Establishment and Characterization of a Human in vitro Cell Model for Parkinson’s Disease

Abstract

A major obstacle on the way to understand the molecular pathogenesis of Parkinson’s disease (PD) and to develop disease-modifying treatments is the lack of suitable model systems that capture the relevant molecular events leading to human disease and are also accessible to compound screening. This cumulative thesis describes the establishment of two novel cellular model systems based on induced pluripotent stem cells (iPSCs): the generation of an in vitro cell model for PD consisting of post-mitotic midbrain dopaminergic neurons, and the derivation and expansion of human neural progenitors for neurodegenerative disease modelling. For the first model, fibroblasts from two female PD patients with a G2019S mutation in the LRRK2 gene and four age- and sex-matched controls were reprogrammed into iPSCs. This was achieved through infection with the four factors Oct-4, Sox-2, Klf-4 and c-myc published by Shinia Yamanaka and isogenic gene-controls were generated using zinc finger nucleases (ZFNs) that differed from the original iPSCs only in the DNA base responsible for the G2019S mutation. Finally, one gene-corrected wild-type-LRRK2 line was obtained for each G2019S-LRRK2 line. In addition, an isogenic G2019S-LRRK2 line was generated for the wild-type-LRRK2 control C4, also through ZFN technology. The iPSCs were then differentiated into midbrain dopaminergic (mDA) neurons by an optimized differentiation protocol. Several studies on these mDA neurons showed that they were electrophysiologically active and expressed neuronal as well as dopaminergic neuronal markers. To clarify whether phenotypic changes can be observed, mDA neuronal cultures were investigated for two already described phenotypes associated with LRRK2: reduced neurite outgrowth and increased sensitivity to oxidative stress. Indeed, a reduced velocity of outgrowing neurons could be observed in G2019S-mutated iPSC-derived neurons. In addition, an increased sensitivity of the mutant neurons against oxidative stress could also be confirmed. As such, these assays suggested that iPSC-derived neurons from PD patients can serve as an in vitro PD model. For further characterization of this PD model, the expression of the proteins alpha-synuclein and TAU or pTAU was investigated, as these proteins are accumulated or hyperphosphorylated in the brain of PD patients. An accumulation on protein level could be stated for both proteins as well as an elevated RNA level for TAU. Mechanistic causes of these phenotypes such as the specific dysregulation of certain genes and an increased activation of Erk1/2 by G2019S-LRRK2 are described in the shared publication of Peter Reinhardt and me from 2013 in Cell Stem Cell: „Genetic Correction of a LRRK2 Mutation in Human iPSCs Links Parkinsonian Neurodegeneration to ERK-Dependent Changes in Gene Expression.“ The second cell model was generated to address the question of the suitability of iPSCs for high-throughput screenings. Due to relatively high heterogeneity, iPSC-derived neurons, as described above, are not ideally suited for this purpose. An additional aim was to develop a cell model that is not solely limited to PD but also allows studying other neurodegenerative diseases. Therefore, an iPSC-derived cell model system was established consisting of a robust neural progenitor cell type that is able to give rise to several neuronal subtypes. Results of this project were published in PLoS One in 2013: “Derivation and Expansion Using Only Small Molecules of Human Neural Progenitors for Neurodegenerative Disease Modeling.”

Die molekularen Pathomechanismen der Parkinson Erkrankung sind bis heute noch immer nicht ausreichend verstanden. Ebenso gibt es keine Behandlungsmöglichkeiten, die effektiv in den Krankheitsverlauf der Parkinson Erkrankung oder auch vieler anderer neurodegenerativer Erkrankungen eingreifen. Der Grund dafür ist, dass keine geeigneten Modelle zur Verfügung stehen, welche relevante, molekulare Merkmale der Krankheiten widerspiegeln oder sich für eine Medikamententestung im Hochdurchsatzverfahren eignen. Im Rahmen dieser kumulativen Dissertation wird die Etablierung zweier neuartiger Zellmodellsysteme beschrieben, die auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) basieren. Das eine Zellmodell beinhaltet reife und postmitotische, dopaminerge Neuronen als in vitro Modell für die Parkinson Erkrankung. Dem anderen Modell liegen proliferierende, neurale Vorläuferzellen zu Grunde, aus welchem ein Modell zur Medikamententestung neurodegenerativer Erkrankungen im Allgemeinen entwickelt wurde. Für das erste Modell wurden Fibroblasten von zwei Parkinson-Patientinnen mit einer G2019S Mutation im LRRK2-Gen und von vier alters- und geschlechtsangepassten Kontrollen durch Infektion mit den von Shinia Yamanaka publizierten Faktoren Oct-4, Sox-2, Klf-4 und c-myc zu iPS-Zellen reprogrammiert. Mit Hilfe von Zinkfingernukleasen wurden isogene Kontrollen generiert, die sich nur in derjenigen Base von den ursprünglichen iPS-Zellen unterschieden, welche die G2019S Mutation verursacht. So wurde für jede G2019S-LRRK2 Linie eine genkorrigierte Wildtyp-LRRK2 Linie angefertigt. Zusätzlich wurde für die unabhängige Wildtyp-LRRK2 Kontrolle C4, ebenfalls über Zinkfingernuklease-Technologie, eine isogene G2019S-mutierte Linie generiert. Die iPS-Zellen wurden anschließend nach einem optimierten Differenzierungsprotokoll zu mittelhirnspezifischen dopaminergen Neuronen differenziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Neuronen elektrophysiologisch aktiv waren und neuronale und dopaminerge Marker exprimierten. Um zu klären, ob sich phänotypische Veränderungen in den dopaminergen Neuronen beobachten lassen, wurden die Neuronen auf zwei bereits beschriebene, LRRK2-assoziierte Phänotypen untersucht: Neuritenauswuchs und Sensitivität gegenüber oxidativem Stress. Es konnte gezeigt werden, dass die Neuritenauswuchsgeschwindigkeit bei den mutierten Neuronen verringert war. Zusätzlich wurde eine erhöhte Sensitivität der mutierten Neuronen gegenüber oxidativem Stress gefunden. Zur weiteren Charakterisierung des Parkinson-Modells aus iPS-Zellen wurde die Expression der Proteine alpha-synuclein und TAU bzw. pTAU untersucht, welche beim Parkinson-Patienten akkumulieren oder hyperphosphoryliert sind. Für beide Proteine konnte eine Anhäufung auf Protein-Ebene und für TAU auch auf RNA-Ebene nachgewiesen werden. Mechanistische Ursachen dieser Phänotypen, wie die spezifische Dysregulierung verschiedener Gene und die Hyperphosphorylierung und daher Überaktivierung von Erk1/2 durch G2019S-LRRK2 sind in der gemeinschaftlichen Publikation von Peter Reinhardt und mir im Journal Cell Stem Cell (2013) beschrieben: „Genetic Correction of a LRRK2 Mutation in Human iPSCs Links Parkinsonian Neurodegeneration to ERK-Dependent Changes in Gene Expression.“ Mit dem zweiten Modell wurde die Tauglichkeit der iPS Zellen für Hochdurchsatz Screenings untersucht. Aufgrund ihrer relativ hohen Heterogenität sind Neuronen, die von iPS-Zellen abgeleitet sind, für diese Anwendung nicht ideal. Aus diesem Grund war ein Ziel dieses Projektes, eine robuste, neurale und expandierbare Vorläufer-Linie zu entwickeln. Ein weiteres Ziel war, das Zellmodell so zu gestalten, dass es sich nicht nur auf Screenings für die Parkinson Erkrankung beschränkt sondern sich auch für andere neurodegenerative Erkrankungen eignet. Daher wurde ein Zellmodell auf der Basis eines robusten neuralen Vorläufers etabliert, welcher in mehrere neuronale Subtypen diffrenziert werden kann. Ergebnisse dieser Arbeit wurden 2013 im Journal PLoS One publiziert: “Derivation and Expansion Using Only Small Molecules of Human Neural Progenitors for Neurodegenerative Disease Modeling.”