Identifikation und Charakterisierung von potentiellen Biomarkern für die Persistenz und Progression einer HPV16-Infektion

Abstract

Eine persistente Infektion mit einem Hochrisiko (HR)-Typ humaner Papillomviren (HPV) ist ein notwendiger Risikofaktor für die Entstehung von zervikalen Krebsvorstufen und eines Zervixkarzinoms. Infektionen mit humanen Papillomviren sind häufig, jedoch verlaufen die meisten HPV-Infektionen transient und heilen spontan aus. In weniger als 30% der Fälle gelingt es dem Virus, sich langfristig zu etablieren und die Infektion bleibt bestehen. Eine Progression dieser persistenten Infektionen kann in ca. 50% dieser Fälle beobachtet werden. In prä-invasiven Läsionen und Zervixkarzinomen wird HPV16 am häufigsten gefunden, jedoch erkranken nicht alle Frauen mit einer HPV16-Infektion. Dies lässt darauf schließen, dass weitere Faktoren einen Einfluss auf den Ausgang einer Infektion mit einem HR-HPV Typ haben. Ziel dieser Arbeit ist die Identifikation solcher potentiellen Biomarker, welche nach einer einmaligen Bestimmung eine Aussage über das Progressionsrisiko einer Frau mit einer persistenten HPV-Infektion treffen können. Mit Hilfe solcher Marker kann die Lebensqualität infizierter Frauen gesteigert, und die wirtschaftliche Belastung reduziert werden. Mit Hilfe einer ca. 11 000 Frauen umfassenden dänischen Kohorte („Junge Dänische Kohorte“) konnten zwei neue prädiktive Biomarker für die Entwicklung einer schweren Dysplasie oder eines Karzinoms in persistent HPV16-infizierten Frauen identifiziert werden: TMEM45a und p16/CDKN2A zeigen eine signifikant höhere Expression in Frauen, welche innerhalb einer medianen Nachbeobachtungszeit von 12,9 Jahren eine hochgradige zervikale Läsion oder schwerer (CIN3+) entwickelten, jedoch zum Zeitpunkt der Probenentnahme eine normale Zytologie aufwiesen. Zuvor publizierte Ergebnisse, dass es sich bei TMEM45A um ein durch Hypoxie reguliertes Gen handelt, konnten bestätigt werden. Eine Induktion der TMEM45A mRNA unter hypoxischen Bedingungen konnte jedoch ausschließlich in HPV-haltigen Zellen beobachtet werden, in HPV-negativen Zelllinien blieb die Menge konstant oder wurde sogar reduziert. Ebenso konnten morphologische Zellveränderungen, Ablösen von Zellen und Zellsterben nach einem „Knock-down“ von TMEM45A durch siRNA nur in HPV-haltigen Zellen beobachtet werden. Eine anti-apoptotische Funktion wurde bereits beschrieben, jedoch konnte der Mechanismus, über den die anti-apoptotische Funktion vermittelt wird, nicht geklärt werden. Mittels RT-PCR wurde eine neue Transkriptvariante von TMEM45A identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass sich das Protein in zytoplasmatischen Vesikeln befindet. Der Proteinnachweis von TMEM45A mittels Immunoblot war durch das Auftreten mehrerer unterschiedlich großer Banden erschwert. Nach der Analyse mehrerer kommerziell erhältlicher Antikörper, sowie der Herstellung eines weiteren anti-TMEM45A-Antikörpers konnte eine Bande identifiziert werden, deren Intensität sich durch Überexpression und siRNA „Knock-down“ spezifisch veränderte. Als mögliche Marker für die Persistenz und Progression einer HPV16-Infektion werden weiterhin sowohl die Viruslast als auch der Integrationsstatus des viralen Genoms diskutiert. Beide Marker wurden in Proben der bereits erwähnten Dänischen Kohorte, sowie einer zweiten, ca. 42 000 Frauen umfassenden Kohorte („LBC-Kohorte“), mit Hilfe der quantitativen Real Time PCR (qRT PCR) bestimmt. Es konnten in der Jungen Dänischen Kohorte signifikante Unterschiede der Viruslast und des Integrationsstatus zwischen transienten und persistenten Infektionen, jedoch nicht zwischen nicht-progredierenden und progredierenden HPV16-Infektionen gefunden werden. Für die Validierung dieser Resultate wurde eine Multiplex-PCR zur simultanen Bestimmung der beiden viralen Proteine E2 und E6, sowie eines Referenzgens zur Zellzahlbestimmung, etabliert. Die Ergebnisse dieser Messungen in der LBC-Kohorte zeigten jedoch überraschenderweise keine signifikanten Unterschiede der potentiellen Marker zwischen transienten und persistenten Infektionen. Aufgrund der Inkonsistenz der Ergebnisse der Viruslast und des Integrationsstatus kann deshalb keine eindeutige Aussage über deren Rolle als Marker für die Persistenz einer HPV16-Infektion getroffen werden.

A persistent infection with a high risk (HR)- human papillomavirus (HPV) is a necessary risk factor for the development of cervical precancer and cancer. Most infections with human papillomaviruses can be cleared by the immune system. However, in less than 30% of the cases the virus establishes a persistent infection. HPV16 is found in most of all pre-invasive lesions and cervical cancers, however, progression of persistent infections can be observed in approximately 50% of all HPV16-infections. This suggests that more modifiers exist that influence the outcome of an infection with a HR-HPV type. The aim of this work is the identification of potential biomarkers with the ability to predict the risk of progression of persistently HPV16-infected women. Quality of life of infected women may increase and economical strain may be reduced by identifying such markers. By means of a large population-based cohort study („Young Danish Cohort“), comprising approx. 11 000 women, two predictive biomarkers for the development of high grade cervical lesions or cervical cancer were identified: The expression of TMEM45a and p16/CDKN2A was significantly higher in women who developed a high-grade cervical lesion or worse within a median follow-up time of 12.9 years, while having a normal cytology at baseline. In addition, previously published results about TMEM45A as a novel hypoxia regulated gene, were confirmed. However, induction of TMEM45A mRNA under hypoxic conditions could only be observed in HPV-containing cells; the amount of TMEM45A mRNA showed no increase but rather decrease in HPV-negative cell-lines. HPV-positive cells showed morphological changes including detachment and cell death after knock-down of TMEM45A by specific siRNAs. An anti-apoptotic function of TMEM45a was previously described, but the mechanism remains unclear. By means of RT-PCR a new transcript variant of TMEM45a was identified and we demonstrated that the protein is located in cytoplasmic vesicles. Detection of TMEM45a protein by western blot was aggravated due to the appearance of several bands at different sizes. After analysis of various commercially available antibodies, as well as the production of an additional anti-TMEM45a-antibody, it was possible to identify a band that specifically changed after TMEM45A overexpression and siRNA knock-down. Furthermore, viral load and physical state of the viral genome are discussed to be potential markers for persistence and progression of a HPV16-infection. Both potential markers were determined in samples of the Young Danish Cohort and in the LBC-Cohort, a second cohort comprising approx. 42 000 women, using quantitative real-time PCR. In the Young Danish Cohort, viral load and physical state showed significant differences between women with transient and persistent HPV16-infections but not between non-progressors and progressors. To validate these results, a multiplex-PCR for simultaneous detection of the viral proteins E2 and E6, as well as a reference gene for normalisation, was established. Surprisingly, no significant differences in viral load and physical state between transient and persistent HPV16-infections were observed in the LBC-cohort. Due to these inconsistencies concerning viral load and physical state, it is not possible to make a clear statement about their role as markers for persistence of a HPV16-infection.