Modeling Flexibility of Protein-DNA and Protein-Ligand Complexes using Molecular Dynamics

Abstract

Molecular dynamics simulations provide valuable insights into the inherent flexibility of biomolecules and complement the static structures obtained from X-ray crystallography. Structural dynamics of proteins and alterations at protein-DNA and protein-ligand binding interfaces can thus be investigated.

Regulation of gene expression plays a pivotal role in cellular processes and is modulated by special proteins binding to specific DNA sequences. WRKY proteins represent a large protein family in plants and are involved in the regulation of developmental processes, such as leaf senescence, as well as in the response to abiotic and biotic stress situations. The highly conserved WRKY DNA-binding domain recognizes predominantly the ‘TTGACC’ W-box consensus sequence. Since all WRKY proteins prefer this DNA sequence motif, it remains unclear so far how stimulus-specific responses are mediated. The W-box sequence might be more degenerate and yet undetected differences at the protein-DNA binding interface might exist. With molecular modeling and molecular dynamics simulations we constructed a first three-dimensional WRKY-DNA complex at atomic detail. Our modeling approach facilitates the investigation of structural differences and similarities of WRKY DNA-binding domains in complex with DNA while accounting for flexibility. Complexes of N- and C-terminal DNA-binding domains of AtWRKY33 with DNA and in silico binding free energy predictions gave a first indication that the N-terminal domain interacts with DNA in a similar way as the C-terminal domain. Additionally, we found an amino acid variation between AtWRKY11 and AtWRKY50 relevant for DNA-binding specificity and thus could explain WRKY DNA-binding motif preferences at the structural level.

Despite significant advances in structure-based drug design techniques during the last years, one remaining challenge is still the accurate representation of flexible proteins in protein-ligand docking. We present a method that can generate and identify possible protein conformations when only a single protein structure is available. These different protein conformations represent the structural space of flexible proteins and can be used as input structures for molecular docking. Aldose reductase, dihydrofolate reductase, and HIV-1 protease are prominent drug targets known for their large backbone flexibility. We tested our method on these three proteins and could identify at least one protein conformation that is highly similar to one of the structures available in the PDB each. Another method we developed is an advanced molecular dynamics simulation and binding affinity prediction protocol for re-scoring docked ligand poses. Our approach can be employed after protein-ligand docking to discriminate between good and inferior binders while additionally accounting for flexibility. When applied to an urokinase ligand dataset, it improves the correlation of 0.57 between experimental binding affinities and docking scores significantly to 0.92. Thus, it can advance the rank-ordering of docking hit lists, especially when applied to structurally similar ligands.

Molekulardynamische Simulationen bieten die Möglichkeit wertvolle Einblicke in die Biomolekülen inhärente Flexibilität zu erlangen und können die Strukturen ergänzen, die durch Röntgenkristallografie gewonnen worden und deshalb bewegungslos sind. Somit können die Flexibilität von Proteinen und die strukturellen Veränderungen an Interaktionsflächen von Protein-DNS und Protein-Ligand Komplexen untersucht werden.

Die Regulation von Genexpression spielt bei allen Entwicklungsprozessen in Zellen eine zentrale Rolle und wird von bestimmten Proteinen kontrolliert, die an spezifische DNS Sequenzen binden. In Pflanzen bilden WRKY Proteine eine große Familie solcher Proteine, die an der Regulation von Entwicklungsprozessen, wie Blattalterung als auch bei der Bewältigung von biotischen und abiotischen Stresssituationen beteiligt sind. Ihre hochkonservierte DNS-Bindedomäne erkennt hauptsächlich die Konsensussequenz ‚TTGACC‘. Da alle WRKY Proteine das gleiche DNS Bindemotiv bevorzugen, konnte bis jetzt nicht eindeutig erklärt werden auf welche Art und Weise stimulus-spezifische Antworten vermittelt werden. Möglicherweise ist die W-Box Sequenz degenerativer und es existieren bisher unbekannte Unterschiede an der DNS-Protein Interaktionsfläche. Durch molekulare Modellierung und molekulardynamische Simulationen konnten wir einen ersten drei-dimensionalen WRKY-DNS Komplex auf atomarer Ebene konstruieren. Unser Modellierungsansatz macht die Untersuchung von strukturellen Unterschieden und Gemeinsamkeiten unter Beachtung von Flexibilität von WRKY DNS-Bindedomänen, die sich in Komplex mit DNS befinden, möglich. Komplexe von N- und C-terminalen DNS-Bindedomänen von AtWRKY33 mit DNS und computergestützte Bindungsenergieberechnungen geben erste Hinweise auf ähnliche DNS-Interaktionen der N-terminalen verglichen mit der C-terminalen Domäne. Außerdem haben wir eine Aminosäurevariation zwischen AtWRKY11 und AtWRKY50 entdeckt, die relevant für die DNS-Bindespezifität ist, und können somit auf struktureller Ebene die Präferenz von WRKY Proteinen zu bestimmten DNS-Bindemotiven erklären.

Trotz bedeutender Fortschritte, die in den letzten Jahren bei Methoden im Bereich des strukturbasierten Wirkstoffentwurfs erreicht wurden, bleibt eine der noch nicht vollständig gelösten Probleme die wirklichkeitsgetreue Repräsentation von flexiblen Proteinen in Protein-Ligand Docking. Wir stellen einen Ansatz vor, der aus einer einzigen verfügbaren Proteinkonformation verschiedene Proteinkonformationen generieren und identifizieren kann. Diese generierten Proteinkonformationen stellen den strukturellen Raum flexibler Proteine dar und können als Eingabestrukturen für Dockingprogramme verwendet werden. Aldosereduktase, Dihydrofolatreduktase und HIV-1 Protease, sind jeweils wichtige Wirkstofftargets und gleichzeitig bekannt für ihre großen Proteinrückgratsbewegungen. Unsere Methode ist anhand dieser drei Proteine getestet worden und es wurde jeweils eine Proteinkonformation gefunden, die sehr ähnlich zu einer der bekannten Proteinstrukturen ist, die in der PDB verfügbar sind. Eine weitere Methode, die wir entwickelt haben, ist ein detailliertes Protokoll für Molekulardynamische Simulationen und Bindungsaffinitätsberechnungen, das die Bindeaffinität gedockter Liganden erneut bewertet. Unsere Methode kann nach einem erfolgreichen Protein-Ligand Dockingdurchlauf angewendet werden, um zwischen gut und schlechter bindenden Inhibitoren zu unterscheiden während gleichzeitig die Flexibilität berücksichtigt wird. Ein Urkokinaseligandendatensatz ist getestet worden, wobei unsere Methode die Korrelation zwischen experimentellen Bindungsaffinitäten und Dockingwerten von 0,57 auf 0,92 verbessert. Unsere Methode kann demnach die Rangkorrelation von Dockingergebnissen erheblich optimieren, insbesondere, wenn sie auf strukturell ähnliche Liganden angewendet wird.