Identification and Functional Analysis of Genes Controlling Germ Cell Migration and Gonad Formation

Abstract

Gonad formation in Drosophila involves the intricate movements of two cell types, the germ cells and the somatic gonadal precursor cells (SGPs), to generate a simple three-dimensional structure. The germ cells must firstly migrate to SGP clusters, which in turn fuse and ensheath the germ cells and the two cell types ultimately coalesce. Underlying this seemingly simple process is an array of genes required to guide germ cells to the SGPs. Additional complex transcriptional networks in SGPs are essential for their specification, maintenance and to initiate their ensheathment behavior. This system represents a good model to study organogenesis using essentially two cell types. In this thesis I have examined aspects of both germ cell migration and SGP behavior. Firstly I examined the role of the Drosophila lipid phosphate phosphatases, Wun and Wun2 (referred to collectively as Wunens), in guiding the migration of germ cells. These multi-pass transmembrane enzymes, expressed both in the germ cells and the embryonic somatic cells, are thought to create an extracellular gradient of lipid phosphate, which is required for both migration and survival of the germ cells. However in order to form this extracellular lipid gradient, Wunens would be expected to act as ecto-enzymes. To investigate the site of requirement of Wun2 activity, I examined the localization of endogenous and different tagged versions of Wun2. Although both the GFP and the Myc tagged Wun2 were functional, the GFP version replicated the endogenous Wun2 plasma membrane localization. In parallel I made a construct in which a TEV protease cleavage site was inserted in a predicted extracellular loop of Wun2. I demonstrated that secretion of TEV protease by neighboring cells reduced the ability of this construct, to rescue wunen loss of function in germ cells. Taken together these data support the notion that the cell surface localization and the ecto-phosphatase activity of Wunens is critical for germ cell migration and survival. Secondly I have characterized the role of three mutants in which gonad formation is defective. In these mutants, although early germ cell migration is unaffected, in later embryos germ cells are scattered and SGP clusters do not fuse or compact. Whole genome sequencing coupled to deficiency complementation was performed to determine the causative mutations in two of the mutants. I identified mutations in two transcription factors, Midline (Mid) and Longitudinals lacking (Lola) and showed that both genes are expressed by SGPs and are required cell autonomously. The mutation in lola affects only one (lola-R) of the 30 predicted lola isoforms. Whilst the SGP defects resulting from mutation of Lola-R could be rescued by expression of this Lola isoform, another functional Lola isoform (Lola-BC) was unable to do so. Therefore, this study identifies the first lola-R specific allele, and describes a role in gonad formation that cannot be substituted by other Lola isoforms. Additionally, I have shown that robust gonad expression of another transcription factor Traffic jam is lost in mid mutants, placing Mid into a SGP transcriptional cascade. Lastly, mid and lola interact genetically suggesting that they could have one or more overlapping downstream targets.

Die Morphogenese der Gonaden in Drosophila beinhaltet die verworrene Bewegung zweier Zelltypen, der Keimzellen und der somatischen Gonadenvorläuferzellen (somatic gonadal precursor cells, SGPs), um schließlich eine einfache dreidimensionale Struktur zu bilden. Die Keimzellen müssen als erstes zu den SGP-Clustern migrieren, die wiederum die Keimzellen umschließen und sich mit ihnen zu einer Gonade verdichten. Diesem scheinbar einfachen Prozess liegen eine Reihe von Genen zugrunde, die notwendig sind, um die Keimzellen zu den SGPs zu leiten. Außerdem sind komplexe Transkriptionsnetzwerke in den SGPs notwendig, um deren Spezifizierung und ihre Erhaltung zu gewährleisten, sowie um die Umhüllung der Keimzellen zu initiieren. Dieses System stellt ein gutes Model dar, um die Organogenese mit nur zwei Zelltypen zu untersuchen. In dieser Arbeit habe ich sowohl Aspekte der Keimzellwanderung, als auch das Verhalten der SGPs untersucht. Als erstes habe ich die Rolle der Drosophila Lipid-Phosphat-Phosphatasen Wun und Wun2 (zusammen bezeichnet als Wunen) bei der Steuerung der Keimzellmigration untersucht. Diese Transmembranenzyme, welche die Membran mehrfach durchspannenden, die sowohl in den Keimzellen, als auch in den somatischen Zellen des Embryos exprimiert werden, wird angenommen, dass sie einen extrazellulären Lipid-Phosphat-Gradienten aufbauen, der sowohl für die Migration, als auch für das Überleben der Keimzellen notwendig ist. Um jedoch diesen extrazellulären Gradienten zu erzeugen, würde erwartet werden, dass Wunen als Ektoenzyme agieren. Um zu ermitteln, an welchem Ort die Wun2-Aktivität benötigt wird, habe ich die Lokalisation von endogenen und unterschiedlich markierten Versionen von Wun2 untersucht. Obwohl sowohl GFP- als auch Myc-markiertes Wun2 funktional waren, hat nur die GFP-Version die endogene Wun2 Plasmamembran-Lokalisation gezeigt. Außerdem habe ich ein Konstrukt hergestellt, in welches eine von der TEV-Protease erkannte Schnittstelle in eine prognostizierte extrazelluläre Schleife von Wun2 eingefügt wurde. Ich habe dabei gezeigt, dass die Sekretion von TEV-Protease durch benachbarte Zellen, die Fähigkeit dieses Konstrukts den wunen Funktionsverlust in den Keimzellen zu retten, verringert. Zusammengefasst unterstützen diese Daten die Auffassung, dass die Lokalisation an der Zelloberfläche und die Ekto-Phosphataseaktivität von Wunen entscheidend für die Keimzellmigration und deren Überleben sind. Als zweites habe ich die Rolle von drei Mutanten charakterisiert, in welchen die Gonadenentwicklung fehlerhaft ist. Obwohl in diesen Mutanten die frühe Keimzellmigration unbeeinträchtigt ist, sind die Keimzellen in älteren Embryonen verstreut und die SGP-Cluster fusionieren oder komprimieren sich nicht. Mittels whole-genome-sequencing und Defizienz-Komplementation wurden die zugrundeliegenden Mutationen in zwei der Mutanten untersucht. Dabei habe ich Mutationen in zwei Transkriptionsfaktoren, Midline (Mid) und Longitudinals lacking (Lola), identifiziert und gezeigt, dass beide Gene von SGPs exprimiert werden und zellautonom erforderlich sind. Die Mutation in lola beeinflusst lediglich eine (lola-R) der 30 prognostizierten lola-Isoformen. Während die SGP-Defekte, die aus der Mutation von Lola-R resultieren, durch die Expression dieser Lola-Isoform gerettet werden konnten , war eine andere funktionale Lola-Isoform (Lola-BC) nicht dazu in der Lage. Demzufolge identifiziert diese Studie das erste lola-R spezifische Allel und beschreibt eine Rolle in der Gonadenentwicklung, die durch andere Lola-Isoformen nicht ersetzt werden kann. Darüberhinaus habe ich gezeigt, dass die stabile gonadische Expression eines anderen Transkriptionsfaktors, Traffic jam, in mid Mutanten verloren geht, was demzufolge Mid in eine SGP-spezifischen Transkriptionskaskade einfügt. Zuletzt interagieren mid und lola genetisch, was suggeriert, dass sie ein oder mehrere gemeinsame stromabwärts –liegende Ziele haben könnten.