Untersuchungen zum Apoptosemechanismus bei Trypanosoma brucei: Effekte von Staurosporin im Vergleich zu Prostaglandin D2 und die Rolle der Endonuklease G

Abstract

Trypanosoma brucei, der Erreger der afrikanischen Schlafkrankheit bei Menschen und der Tierseuche Nagana, durchläuft während seines komplexen Lebenszyklus mehrere Stadien sowohl im Insektenvektor, der Tsetse-Fliege als auch im Säugerwirt. Im Blut des Wirtes wird die Zelldichte der Parasiten zum einen durch das Immunsystem zum anderen aber auch durch die Produktion von Prostaglandin D2 durch die Parasiten selbst immer wieder herabgesetzt. Dadurch können die Parasiten im letzten Stadium der Krankheit das Gehirn der betroffenen Patienten befallen. Auch im Liquor von Schlafkrankheitspatienten konnten erhöhte Konzentrationen von Prostaglandin D2 gemessen werden.

Der altruistische Zelltod einzelliger Parasiten wie Trypanosoma brucei ist der Fokus vieler wissenschaftlicher Fragen. Die Existenz eines programmierten Zelltodes in T. brucei ist weitläufig anerkannt. Dessen Mechanismus und die beteiligten Enzyme sind allerdings längst noch nicht aufgeklärt. Mit der Entdeckung des Prostaglandins D2 als von den Parasiten selbst produzierten Auslöser des Zelltodes wurde ein erster wichtiger Schritt für die Entschlüsselung dieses Mechanismus gemacht. Schlüsselenzyme wie die Cyclooxygenase, der Differenzierungsfaktor (DIF) oder ein Apoptose induzierender Faktor (AIF) wie sie in höheren Organismen vorhanden sind, fehlen allerdings noch immer auf der Karte der Trypanosomen. Das Vorhandensein eines COX-ähnlichen Enzyms steht außer Frage, wie die Ergebnisse der Dünnschicht-Chromatographie mit trypanosomalem Zelllysat und [C-14]-Arachidonsäure gezeigt haben. Die schrittweise Isolierung des Proteins führte zu einem, durch die massenspektrometrische Analyse, eindeutig zugeordneten Protein, welches als Tb427.10.13790 identifiziert werden konnte. Nach der Expression dieses Proteins in E. coli Zellen konnte allerdings aufgrund der Expression in inclusion bodies keine eindeutige Cyclooxygenaseaktivität durch die Dünnschicht-Chromatographie mit [C-14]-Arachidonsäure gezeigt werden. Die endgültige Verifizierung des in dieser Arbeit als TbCOX isolierten Proteins steht also noch aus. Allerdings sind die vorhandenen Ergebnisse vielversprechend. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in der löslichen Fraktion von T. brucei Zelllysat ein Protein mit nachweisbarer Peroxidaseaktivität und wohl auch Cyclooxgenaseaktivität, das ein ähnliches Molekulargewicht wie die Cyclooxygenasen höherer Organismen besitzt und mit anti COX-1 Antikörper detektiert werden kann, exisitiert.

Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Staurosporin (STS), ein Alkaloid, das in Säugerzellen aber auch Protozoen wie Leishmanien ein Auslöser der Apoptose ist, in T. brucei eine andere Art von Zelltod induziert als PGD2. Die durchflusszytometrischen Analysen von STS-induzierten Trypanosomen zeigten die gleichen apoptotischen Charakteristika wie die Apoptose höherer Organismen oder PGD2-induzierter Trypanosomen. Allerdings wurden Merkmale wie der G1-Phasen-Arrest oder eine de novo Proteinbiosynthese mit STS nicht erfüllt, was aber auch bei Studien unterschiedlichster Zelllinien beobachtet wurde. Somit konnte in dieser Arbeit ein weiterer Induktor eines programmierten Zelltodes in T. brucei gefunden werden, dessen Wirkweise sich aber vom apoptotischen Zelltod, ausgelöst durch PGD2 und dessen Metabolite der J-Serie, unterscheidet. Der zeitliche Verlauf der durch PGD2 bzw. STS ausgelösten Zelltodarten lässt sich mit der Apoptose Typ II vergleichen. Zu Beginn der Apoptose steigt die Produktion intrazellulärer ROS, insbesondere der Superoxid-Anionen stark an, gefolgt von einem Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) und Externalisierung von Phosphatidylserin. Der Verlust des MMP führt, wie in höheren Eukaryonten, zur Freisetzung der Endonuklease G in das Zytosol und den Zellkern. Die freigesetzte EndoG führt dann, wahrscheinlich in einem DNA-Degradasomen-Komplex mit weiteren Nukleasen, wie er z.B. bei L. donovani oder C. elegans schon beschrieben wurde, zur Fragmentierung der DNA im Zellkern. Die DNA-Fragmentierung ist der letzte messbare Vorgang des Apoptoseprozesses in T. brucei. Somit konnte hier das Superoxid-Anion als zentrale ROS bei der Induktion und die EndoG als wichtige Nuklease bei der Apoptose in T. brucei identifiziert werden. Die Überexpression der EndoG in T. brucei führte zum raschen Absterben der Zellpopulation und molekularbiologischen Veränderungen in den Zellen. Dies und die Tatsache, dass die Expression von trypanosomaler wie auch eukaryontischer EndoG in E. coli Zellen zum Einschluss in inclusion bodies führt, ist ein Indiz für die Vorläuferstellung des viel größeren, dennoch in seiner Aktivität gleichen Enzyms der Protozoen. Auch hier ist EndoG ein wichtiger Bestandteil des programmierten Zelltodes. Diese Ergebnisse lassen hoffen, dass noch weitere, am apoptotischen Zelltod beteiligte Enzyme, die in T. brucei bisher noch nicht bekannt sind, folgen.

Trypanosoma brucei, the causative agent of African sleeping sickness in humans and the nagana disease in cattle undergoes a complex lifecycle with several stages in both the insect vector, the tsetse fly and in the mammalian host. In the blood of the host the parasites cell density is reduced to one by the immune system on the other, by the production of prostaglandin D2 (PGD2) by the parasites themselves. Thus the parasites can affect the brain of affected patients in the last stage of the disease. Also in the cerebrospinal fluid of sleeping sickness patients elevated levels of prostaglandin D2 could be measured.

The altruistic cell death of unicellular parasites such as Trypanosoma brucei is the focus of many scientific questions. The existence of a programmed cell death in T. brucei is widely accepted. Its mechanism and the enzymes involved are, however, far from being elucidated. With the discovery of prostaglandin D2 as a trigger of cell death produced by the parasite itself, an important first step for the decryption of this mechanism has been made. Key enzymes such as cyclooxygenase, the differentiation factor (DIF), or apoptosis inducing factor (AIF) which are present in higher organisms are still missing on the map of trypanosomes. The presence of a COX-like enzyme is beyond question, as the results of thinlayer chromatography with trypanosomal cell lysate and [C-14]-arachidonic acid showed. The progressive isolation of the protein resulted in a clearly associated protein that could be identified by mass spectrometric analysis as Tb427.10.13790. After expression of this protein in E. coli cells no clear cyclooxygenase activity could be shown by thinlayer chromatography with [C-14]-arachidonic acid due to the expression in inclusion bodies. The final verification of the isolated protein as TbCOX in this work is therefore still pending. Certainly, the present results are promising. In this thesis it was shown that in the soluble fraction of T. brucei cell lysate, there is a protein with detectable peroxidase activity and probably cyclooxgenase activity, which has a molecular weight similar to the cyclooxygenases in higher organisms and which can be detected with anti COX-1 antibodies.

In the second part of this thesis it was shown that staurosporine (STS), an alkaloid that triggers apoptosis in mammalian cells but also in protozoa such as Leishmania, induces a different type of cell death in T. brucei as PGD2 does. The flow cytometric analysis of STS-induced trypanosomes showed the same characteristics as apoptosis of higher organisms or PGD2-induced trypanosomes. However, with STS characteristics such as the G1 phase arrest or de novo protein synthesis were not met, but this was also observed in studies of different cell lines. Thus in this thesis another inducer of programmed cell death in T. brucei was found, but its mode of action differs from the apoptotic cell death induced by PGD2 and its metabolites of the J-series. The time course of PGD2 or STS-induced cell death can be compared to that of type II apoptosis. At the beginning of apoptosis, production of intracellular ROS increases, in particular that of superoxide anions, followed by a loss of the mitochondrial membrane potential (MMP) and externalization of phosphatidylserine. As in higher eukaryotes, loss of MMP results in the release of endonuclease G into the cytosol and the nucleus. Released EndoG then leads, probably in a DNA degradasome complex with other nucleases, as described in L. donovani or C. elegans, to fragmentation of DNA in the nucleus. DNA fragmentation is the last measurable operation of the apoptosis process in T. brucei. Hence, the superoxide anion and EndoG could be identified as a central ROS and a major nuclease during induction of apoptosis in T. brucei. Overexpression of EndoG in T. brucei led to rapid death of the cell population and molecular changes within the cells. This and the fact that expression of trypanosomal as well as eukaryotic EndoG leads to inclusion bodies in E. coli cells is an indication for the precursor position of the much larger, but in its activity same, enzyme of the protozoa. Herein, EndoG is also an important component of programmed cell death. These results let hope that further enzymes involved in apoptotic cell death, which so far are not known in T. brucei will follow.