Funktionelle Auswirkungen Epilepsie-assoziierter Kaliumkanalmutationen

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-69975
http://hdl.handle.net/10900/49938
Dokumentart: Dissertation
Date: 2013
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Lerche, Holger (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2013-07-22
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Epilepsie , Elektrophysiologie
Other Keywords: KCNQ , Kanalopathie , Transfektion von Neuronen
Channelopathy
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Die spannungsabhängigen Kaliumkanäle KV7.2 und KV7.3 generieren den M-Strom in Nervenzellen und sind an der Regulation von Aktionspotentialen beteiligt. Mutationen in diesen Kanälen können einen Funktionsverlust verursachen, was zu reduzierten M-Strömen und erhöhter Erregbarkeit von Nervenzellen führt und neurologische Krankheiten auslösen kann. Die Untersuchung von Auswirkungen der Mutationen auf Struktur und Funktion des Kanals ist von großer Bedeutung für das Verständnis von Pathomechanismen und der gezielten Entwicklung pharmakologischer Reagenzien zum Entgegenwirken der Effekte. Dabei ist es wünschenswert, möglichst physiologische und Patienten-ähnliche Analysebedingungen zu schaffen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Struktur-Funktions-Korrelation eines in vielen KV-Kanälen hoch konservierten Threonin-Restes aufgeklärt und der Effekt eines Austauschs der Aminosäure in KV7.2 und KV7.3 auf die Funktion des Kanals hin untersucht. Der Austausch bewirkt eine Verschiebung der Aktivierungskurve zu depolarisierteren Potentialen mit verlangsamter Aktivierung und beschleunigter Deaktivierung, was eine Präferenz des Kanals zum geschlossenen Konformationszustand impliziert. Dem Thr-Rest wird eine wichtige Rolle für die Stabilisierung des Kanals durch Verbindung des S1-S2-Bereiches mit der S5-Porenregion zugeteilt. Im zweiten Teil wurde durch Expression Epilepsie-assoziierter KV7.2-Mutationen mittels lentiviraler Transduktion von heterozygoten KCNQ2-K.O.-Mauskulturen ein neues System zur Untersuchung von Ionenkanalmutionen entwickelt. Die elektrophysiologische Analyse der krankheitsverursachenden KV7.2 – Kanalmutationen R207Q und N258S konnte in Einzelzellableitungen und auf Multielektroden-Arrays (MEAs) im Netzwerk veränderte Ströme und Feuerungsverhalten nachweisen, was auf übererregbare Zellen und erhöhte Aktivität hinweist und damit die Entstehung der neurologischen Symptome erklären kann. Die Expressionsanalyse konnte fluoreszenzmikroskopisch und im Western Blot einen Trafficking-Defekt mit dominant-negativem Effekt der N258S-Mutation in Neuronen nachweisen. In der Einzelzell-Patch-Clamp Analyse der R207Q-Mutation in Neuronen konnte erstmals über einfache Transduktion / Transfektion die Auswirkung einer KV7.2-Mutation auf das Feuerungsverhalten untersucht werden. Der reduzierte M-Strom und die spätere Aktivierung der Kanäle mit Mutation wirken sich bei stärkeren Reizen mit längeren AP-Folgen durch eine leicht erhöhte Feuerungsrate bzw. übererregbare Zellen aus. Die Analyse des Netzwerk-Feuerungsverhaltens auf MEAs ergab für heterozygote Kulturen, die zusätzlich WT-Kanäle exprimieren, im Vergleich zu Kulturen, die entweder mit mutierten Kanälen oder nur GFP transduziert sind, eine niedrigere Feuerungsrate sowie niedrigere Netzwerk-Synchronizität. Dies zeigt eine höhere Ausprägung epileptischer Eigenschaften für Neurone mit verminderter Anzahl oder defekten KV7.2-Kanälen.

Abstract:

The voltage-gated potassium channels KV7.2 and KV7.3 (KCNQ2 and 3 genes) generate the m-current in neurons and regulate action potential firing. Mutations in these channels can lead to loss-of-function with reduced m-current and increased excitability of the neurons, which can result in neurological diseases. Characterisation of the effects of mutations on channel structure and function is important for the understanding of pathomechanisms and establishment of therapeutics. In the first part of this work, the effects of exchange of a highly conserved Threonine residue in the S1-S2-loop of KV7.2 and KV7.3 was analysed using whole-cell patch clamp technique. Mutation of this residue leads to a depolarizing shift of the activation curve, slowed activation and accelerated deactivation, which indicates a potential role for this threonine in stabilizing the open state conformation. In the second part of this work, KV7.2 subunits with disease-related mutations were expressed in hemizygous KCNQ2 mouse neurons via lentiviral transduction and m-current and firing behaviour were compared to WT situation. Expression analysis, single-cell pach-clamp recordings and network activity recordings on multi-electrode arrays were performed. The R207Q and N258S mutation showed increased firing activity with different pathomechanisms that could explain the neurological symptoms associated with these mutations.

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