Next generation sequencing of DNA extracted from mummified tissue

Abstract

The application of next generation sequencing (NGS) has dramatically increased the amount of genetic information over the last few years. In the current study, DNA samples from eight Egyptian mummies were obtained and tested for the first time using the NGS technology. They were radiocarbon dated and placed within a time period between the Third Intermediate and the Graeco-Roman times (806 BC–124 AD). Initial characterization experiments using different established protocols for DNA extraction and polymerase chain reaction (PCR) and NGS showed variabilities in the retrievability and amplifiablitiy of the extracted DNA from the various Egyptian mummy samples. This can be due to the differences in the preservation status of the mummies or to the technical handling through the NGS multistep protocol. The inadequate storage environment within the mummy collection was the inducer of a bacterial bloom in the Egyptian mummy samples. This could be inferred from the reversal of the Eukaryota/Bacteria ratio in different samples taken from the same mummy after a lapse of time interval of 1.5-2.0 years. We found that increasing the DNA concentration for NGS had a positive effect on the quality of the NGS library and the subsequent sequencing. As a result of a series of optimization experiments, the complete human mitochondrial genome of one mummy was recovered with an average coverage of 190 folds using the unique mapped reads. Using the identified mitochondrial SNPs of this mummy, haplogroup I2 was defined with a quality score of 97.7%. In addition, we address some of the SNPs that might be associated with certain human disease. Since the results largely depend on the used bioinformatics tools, efforts were done to increase the findings' specificity and interpretation accuracy. From eight mummies, twenty-one data-sets were generated and six of them were analyzed in a metagenomic approach. It is known that the ancient Egyptians used a number of natural substances in the mummification procedure. A variety of Viridiplantae taxa were detected and some of them were documented as embalming materials in ancient texts. A number of these findings were confirmed by the conventional but sensitive and specific PCR method. According to stringent analyses, the pathogens Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii were detected in Egyptian mummies. Comparison was also done between the warm climate samples including Egyptian mummies and two Bolivian lowland skeletons on one hand, and the previously published cold climate NGS data-sets of the Saqqaq, the Denisova hominid and the Alpine Iceman. A unique bacterial fingerprint could be assigned to the mummy group, comprising the Egyptian mummies and the Iceman mummy regardless of the different burial conditions. This showed that the metagenome of mummies is relatively unique, thus independent from the parameter temperature.

Die Anwendung von “Next-generation sequencing” (NGS) hat die Genetik revolutioniert und konsequenterweise eine Masse an neuen Genomdaten geliefert. In meiner Dissertation habe ich Biopsien von von acht ägyptischen Mumien erhalten und habe sie mit Hilfe der neuen NGS Technologie untersucht. Alle Proben wurden zudem über die 14C-Methode absolut datiert und stammen aus der Zeit von 806 v. Chr. bis 124 n. Chr.; dies deckt sich mit einer Epoche, die sich von der dritten Zwischenzeit bis hin zur griechisch-römischen Zeit erstreckt. Eine erste Charakterisierung aller Mumienproben über verschiedene DNA-Extraktionstechniken, konventionelle PCR Protokolle und NGS zeigte sehr schnell, dass es individuelle Unterschiede im Hinblick auf z.B. Inhibition, Extraktionsverhalten und Amplifizierbarkeit gab. Dies kann z.B. durch Unterschiede im Erhaltungszustand der Mumien oder aber auch durch das komplexe „Handling“ während des NGS Multistep-Protokolls erklärt werden. Unterschiede konnten auch an Mumien festgestellt werden, die unsachgemäß in den Sammlungen gelagert worden waren (Temperatur, Luftfeuchtigkeit, etc.). Proben von derselben Mumie, die aber in einem Abstand von anderthalb bis zwei Jahren genommen wurden, zeigten eindeutig das Ergebnis einer Bakterienblüte, weil sich das Verhältnis von Eukaryonten DNA zu Bakterien DNA umkehrte. Ich konnte feststellen, dass das Anheben der DNA Konzentration für das NGS einen vorteilhaften Effekt sowohl auf die Qualität der zu erstellenden DNA Bibliotheken als auch auf das Sequenzieren im Speziellen hatte. Der Endpunkt einer Serie von Optimierungsstrategien war das Sequenzieren der DNA einer Mumie, bei der ich das komplette mitochondriale Erbgut mit einer 190-fachen Abdeckung erstellen konnte; hierbei nutze ich nur die über SAMtools als einzigartig deklarierten Fragmente, d.h. alle redundanten Sequenzen waren zuvor aussortiert worden. Die Auswertung der diagnostischen mitochondrialen SNPs ergab, dass es sich hierbei um die Haplogruppe I2 handelte (Qualitäts-Score von 97,7%). Zusätzlich habe ich SNPs bewertet, die nach heutiger Erkenntnis mit bestimmten Erkrankungen des Menschen assoziiert sein könnten. Da die über NGS generierten Ergebnisse in hohem Maße von den benutzen bioinformatischen „Tools“ abhängen, habe ich großen Wert auf Parameter gelegt, die die Spezifität, Stringenz und Akkuratesse der Analysen erhöhen. Insgesamt wurden von acht Mumien einundzwanzig Datensätze generiert, wobei sechs davon genauer auf das Metagenom hin untersucht wurden. Es ist allgemein bekannt, dass die alten Ägypter eine ganze Reihe von Naturstoffen im Rahmen der Mumifizierung benutzen. Eine ganze Reihe von Taxa aus der Gruppe Viridiplantae wurden identifiziert, und einige davon sind auch tatsächlich in den alten Schriften als Bestandteil des Balsamierungsrituals beschrieben. Die sowohl sensitive als auch spezifische Methode der konventionellen PCR konnte ich nutzen um einige der Pflanzen unabhängig zu bestätigen. Hochstringente Analysen ergaben, dass sich in den ägyptischen Mumien auch die DNA von Pathogenen wie Plasmodium falciparum oder Toxoplasma gondii finden ließ. Schlussendlich strebte ich noch einen Vergleich zwischen Proben aus warmen Klimazonen (ägyptische Mumien, Tieflandskelette von Bolivien) und solchen aus Kaltklimaten an (Saqqaq Paläoeskimo, Denisovamensch, Tyroler Eismann). Ein hochspezifischer „bakterieller Fingerprint“ zeigt an, wenn es sich um Mumienmaterial handelt, wobei die Mumiengruppe hier aus den ägyptischen Mumien und der alpinen Gletschermumie bestand. Da sie aus unterschiedlichen Fundhorizonten und Klimaten stammen, belegt dies, dass das Metagenom von Mumien temperaturunabhängig überdauert.