Entwicklung von immunoaffinitäts- und massenspektrometriebasierten Assays - Quantitative Expressionsanalyse von G Protein gekoppelten Rezeptoren

Abstract

Die hohe physiologische Bedeutung und das daraus resultierende große Interesse der pharmazeutischen Industrie an G Protein-gekoppelten Rezeptoren unterstreichen den Bedarf an neuen geeigneten Methoden zur Analyse der größten Gruppe von Membranrezeptoren. Immunoaffinitäts- und massenspektrometrie-basierte Ansätze bieten für eine quantitative Analyse von Membranproteinen viele Vorteile gegenüber Standardmethoden der Proteinanalytik. Wie in dieser Arbeit exemplarisch anhand von Western Blot Analysen gezeigt, sind bisher keine geeigneten Antikörper zum Nachweis von GPCRs verfügbar. Dies liegt an der Vielzahl von Isoformen, der hohen Homologie und den Schwierigkeiten, die sich bei der klassischen Herstellung von Antikörpern gegen Transmembranproteine ergeben. Es wurde gezeigt, dass das TXPKonzept für den Einsatz in der Analyse von G Protein-gekoppelten Rezeptoren sehr gut geeignet ist. Bioinformatische Berechnungen zeigten, dass es theoretisch möglich ist, mit nur 11 TXP-Antikörpern im Menschen 155 Peptide für eine massenspektrometrische Analyse anzureichen. Mit den gleichen TXP-Antikörpern können aus Mausgewebe 263 und aus Rattengewebe 309 proteo-typische Peptide angereichert werden. Die in dieser Arbeit generierten TXP-Antikörper wurden in Bindungsstudien und in funktionellen Test mit Hilfe eines kompetitiven Immunoassays und mit massenspektrometrischen Analysen ausgiebig charakterisiert. Das neue bioinformatische Werkzeug MATERICS wurde verwendet, um Epitope von TXP-Antikörpern nach Immunpräzipitationen aus komplexen, enzymatisch verdauten Proben zu charakterisieren. Nach der Charakterisierung wurden die Antikörper erfolgreich für die qualitative und quantitative Analysen von vier GPCR-Proteinen in drei verschieden Rattengeweben eingesetzt. In der vorgestellten Arbeit wurde eine schnelle und sensitive Methode etabliert, welche die quantitative Analyse von G Protein-gekoppelten Rezeptoren ermöglicht. Diese Methode bietet die Möglichkeit akkurat und effizient Messungen zur Quantifizierung von Transmembranproteinen durchzuführen. In dieser Arbeit konnten zum ersten Mal G Protein-gekoppelte Rezeptoren auf Peptidebene quantifiziert werden. Dabei wurden unterschiedliche Protein-Expressionen in verschiedenen Gewebeproben nachgewiesen.

The method described in this work offers a sensitive and fast way to detect and quantify G protein-coupled receptors on the protein level. A successful quantitation was shown for five different receptors in rat tissue samples.