Structural analysis of a bidirectional nuclear transport receptor, Importin13

Abstract

Nucleocytoplasmic transport of thousands of molecules is an essential feature of eukaryotic cells. The bulk of the active transport between cytoplasm and nucleus is performed by Ran-dependent nuclear transport receptors known as karyopherins or Importin beta-like proteins. Karyopherins involved in the transport of cargoes into the nucleus are called importins, while karyopherins known as exportins export cargoes out of the nucleus. The directionality of transport is driven by a gradient of the small GTPase Ran. In case of importins, RanGTP binding triggers the release of the cargo, while for exportins, the binding of RanGTP mediates the cargo binding. One of the few bidirectional karyopherins that can both import and export cargoes is Importin13 (Imp13). In addition to several other import cargoes, Imp13 imports Mago-Y14, a core component of the exon-junction-complex (EJC), and Ubc9, the only E2-conjugating enzyme of the sumoylation pathway, into the nucleus. The only export cargo identified to date for Imp13 is the eukaryotic initiation factor 1A (eIF1A), which is essential for translation initiation in the cytoplasm. When I started working on Imp13, detailed structural knowledge on the import factors Importin beta (Imp beta) and Transportin (Tnp) and on the export receptor CAS was available. Only two karyopherins Msn5 and Imp13, were known to be bidirectional transport receptors. In 2009, the structures of the exportins Crm1, ExportinT (Expt) and Exportin5 (Exp5) in complex with RanGTP and their cargoes were published. In the same year, Exportin4 (Exp4) was also identified as a bidirectional transport receptor. However, the molecular understanding of how bidirectional transport receptors such as Imp13 function was limited. How Imp13 can recognize diverse cargoes lacking a typical nuclear localization signal (NLS) or nuclear export signal (NES) was an unresolved question. Furthermore, the means with which RanGTP associates to the same receptor to mediate both cargo release and cargo binding were unclear. During my PhD work I used biochemical assays and x-ray crystallography to elucidate the molecular mechanism underlying Imp13 mediated transport. I first focused on the import branch of the Imp13 cycle. Using biochemical assays, I investigated the nuclear transport mechanism of Mago-Y14 by Imp13. I crystallized and solved the structure of the Imp13-Ubc9 complex at 2.8 Å resolution. Furthermore, I characterized the transport mechanism by in vitro co-precipitation-, competition- and sumoylation assays to further complement information obtained from the structures. I found that Imp13 employs completely different interaction surfaces for binding its import cargoes Mago-Y14 and Ubc9. Ubc9 is bound by the N-terminal arch of Imp13 with the same interaction surface also used for RanGTP binding, while Mago-Y14 is bound in the middle and C-terminal part of Imp13. In in vitro competition assays, both cargoes can displace each other from Imp13 to a similar extent, but cannot bind at the same time. Consistently, the dissociation constants (KD) of Imp13 for both import cargoes is in the same range, between 230 and 370 nM. Furthermore, RanGTP induces the release of both import cargoes by different mechanisms. RanGTP directly competes for the binding surface of Ubc9 on Imp13, whereas it displaces Mago-Y14 by a steric hindrance mechanism. In the second half of my PhD, I focused on the export part of the Imp13 cycle. I crystallized and solved the Imp13-RanGTP-eIF1A complex at 3.6 Å resolution. eIF1A is bound at the inner surface of the C-terminal arch of Imp13 adjacent to RanGTP with a KD of 3 µM. The import cargo Mago-Y14 and the export cargo eIF1A share the same interaction surface on Imp13. The comparison between Imp13 import and export complexes reveals that the direction of the transport is determined by a mutually exclusive binding between import cargo and RanGTP and a concomitant binding with the export cargo. Furthermore, I solved the structure of the cytosolic cargo-free state of Imp13 at 3.0 Å resolution. The structure of free Imp13 reveals an overall open conformation, largely incompatible with the binding of eIF1A in the cytoplasm. In conclusion, Imp13 is a remarkably versatile nuclear transport factor which recognizes the shape of its cargoes by wrapping around them with its inner surface and thereby changing its conformation ranging from an open superhelix to a closed ring. A simple principle in which the size and charge of the cargo determines the direction of transport underlies Imp13's unusual function in nucleocytoplasmic transport.

Der kontrollierte Austausch von tausenden Molekülen zwischen Zytoplasma und Zellkern ist für eukaryotische Zellen überlebensnotwendig. Der Großteil des aktiven Transports wird von Ran-abhängigen Proteinen ausgeführt, die als Karyopherine bezeichnet werden. Karyopherine, die den Transport von Kargos in den Zellkern durchführen, heißen Importine, während Exportine Kargos aus dem Zellkern exportieren. Die Richtung des Transports wird durch einen Konzentrationsgradienten des Proteins Ran gesteuert. Bei Importine führt die Bindung von RanGTP zur Freilassung des Kargos, während für Exportine die Bindung von RanGTP notwendig für die Bindung des Kargos ist. Importin13 (Imp13) gehört zu den wenigen bidirektionalen Karyopherinen, denn es kann Kargos sowohl in den Zellkern als auch aus dem Zellkern transportieren. Neben vielen anderen Kargos importiert Imp13 Mago-Y14 und Ubc9. Mago-Y14 bildet zusammen mit zwei anderen Proteinen den Exon-Junction-Complex und Ubc9 ist ein an der Sumoylierungs-Reaktion beteiligtes Enzym. Das einzige bekannte Export-Kargo von Imp13 ist eIF1A. eIF1A ist für die Initiation der Translation im Zytoplasma notwendig. Als ich mit meiner Arbeit an Imp13 begann, waren Strukturen der Importine Imp-beta und Transportin sowie des Exportins CAS veröffentlicht. Zu diesem Zeitpunkt waren nur Msn5 und Imp13 als bidirektionale Karyopherine bekannt. Kurze Zeit später wurden die Strukturen der Exportine Crm1, Expt und Exp5 in Komplex mit RanGTP und einem ihrer Export-Kargos veröffentlicht. Zur gleichen Zeit wurde Exp4 als ein weiteres bidirektionales Karyopherin identifiziert. Die molekulare Grundlage für die Funktion von bidirektionalen Karyopherinen, wie zum Beispiel Imp13, blieb jedoch weiterhin unbekannt. Eine weitere Frage war, wie Imp13 verschiedene Proteine erkennen und transportieren kann, die keine typische Lokalisierungssequenz aufweisen? Es war ebenfalls nicht geklärt, wie die Bindung von RanGTP am selben Karyopherin die Bindung eines Kargos und gleichzeitig die Abgabe eines anderen Kargos bewirken kann. In meiner Doktorarbeit klärte ich mittels Röntgenkristallographie und biochemische Methoden den molekularen Transport-Mechanismus von Imp13 auf. Im ersten Teil meiner Arbeit befasste ich mich mit dem Import von Kargos durch Imp13 und untersuchte mit biochemischen Methoden den Transport-Mechanismus von Mago-Y14. Ich kristallisierte den Komplex aus Imp13 und Ubc9 und löste seine Struktur bei 2.8 Å Auflösung. Darüber hinaus charakterisierte ich mit in vitro Copräzipitations- und Sumoylierungs-Untersuchungen den Transport-Mechanismus von Ubc9. Die Strukturanalyse zeigte, dass Imp13 verschiedene Interaktionsoberflächen für die Bindung von Mago-Y14 und Ubc9 verwendet. Ubc9 wird von der N-terminalen Hälfte von Imp13 gebunden, während Mago-Y14 von der C-terminalen Hälfte von Imp13 erkannt wird. In in vitro Kompetitions-Untersuchungen verdrängen sich beide Proteine gleichermaßen und können nicht gleichzeitig an Imp13 binden. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis ergaben die Messung der Dissoziations-Konstanten (KD) von Imp13 für beide Kargos Werte im gleichen Bereich (rund 300 nM). Ich zeigte ebenfalls, dass die Bindung von RanGTP an Imp13 die Dissoziation beider Kargos über verschiedene Mechanismen induziert. RanGTP konkurriert direkt mit Ubc9 um dieselbe Interaktionsoberfläche, während Mago-Y14 durch eine sterische Hinderung aus dem Komplex verdrängt wird. Im zweiten Teil meiner Arbeit konzentrierte ich mich auf den Export von eIF1A durch Imp13. Ich kristallisierte den Komplex aus Imp13-RanGTP-eIF1A und löste seine Struktur bei 3.6 Å Auflösung. Die Bindestelle für eIF1A liegt auf der Innenseite von Imp13 in dessen C-terminalen Hälfte neben RanGTP. Der KD-Wert beträgt 3 µM. Die Imp13-Interaktionsfläche von eIF1A und Mago-Y14 überlappen. Der Vergleich zwischen den Import- und Export-Komplexen zeigt auf, dass die Richtung des Transports durch eine sich gegenseitige ausschließende Bindung von Import-Kargos und RanGTP und eine gleichzeitige Bindung mit dem Export-Kargo bestimmt wird. Zudem löste ich die Struktur von freiem Imp13 bei 3.0 Å Auflösung. Die Struktur von freiem Imp13 zeigt eine offene Konformation, die größtenteils inkompatibel mit der Bindung von eIF1A ist. Dies deutet darauf hin, dass Imp13 im Zytosol nach Abgabe von RanGTP eIF1A ebenfalls nicht mehr binden kann. Zusammenfassend ist Imp13 ein außergewöhnlich vielseitiges Karyopherin, das mit seiner inneren Oberfläche seine Kargos an ihrer Form erkennt und dadurch seine Konformation von einer offenen Superhelix bis zu einem geschlossenen Ring ändern kann. Der Bidirektionalität von Imp13 liegt ein einfaches Prinzip zu Grunde, bei dem die Größe und die elektrostatische Ladung des Kargos die Transportrichtung bestimmt.