Die Bedeutung von Kinesin-1 und Kinesin-3 basiertem Transport für die Entwicklung und Stabilisierung von Synapsen in Drosophila melanogaster

Abstract

Schneller anterograder Transport ist sowohl für die richtige Entwicklung des Nervensystems als auch für den Schutz der Synapsen vor Degeneration unerlässlich. In dieser Arbeit untersuche ich die vielfältigen Effekte von Mutationen in den beiden wichtigsten anterograden Motoren: Dem Kinesin-3 Mitglied Unc-104 und dem Kinesin-1 Mitglied Khc. Interessanterweise sind Mutationen in beiden Motoren mit hereditärer spastischer Spinalparalyse (HSP) in Verbindung gebracht worden. HSP umfasst eine Gruppe von erblichen neurologischen Krankheiten. Das Hauptmerkmal der HSP ist die progressive Spastik der unteren Gliedmaßen aufgrund von Funktionsstörungen in Nervenzellen. Dabei ist das Kinesin-3 Mitglied unc-104 das Drosophila Homolog von kif1a, dem Spastischen Paraplegie Gen 30 (SPG30). Das Kinesin-1 Mitglied khc ist das Homolog von kif5a, dem SPG10 Gen. In einem anatomischen Screen von neurologischen Mutanten konnte unc-104bris als neue Mutation in unc-104 identifiziert werden. Von unc-104 wurde gezeigt, dass es für den schnellen axonalen Transport der synaptischen Komponenten und Reifung von embryonalen synaptischen Boutons wichtig ist. Unc-104bris ist eine Punktmutation (R561H) in einem vollständig konservierten Bereich der FHA-Domäne von unc-104. Diese Mutation führt nicht zu einer Reduzierung der Proteinmenge, jedoch kommt es zu Beeinträchtigungen der Proteinfunktionen in unc-104 Loss-of-Function Mutanten. Dies geschieht höchstwahrscheinlich durch eine Beeinträchtigung der Regulation der Kinesinaktivität, welche für das energiegekoppelte Beladen von Frachten wichtig ist. Es konnten neue zelluläre Funktionen von Unc-104 in Drosophila beschrieben werden. Zudem konnte beobachtet werden, dass Unc-104 die präsynaptische Reifung von benachbarten einzelnen Synapsen an der neuromuskulären Verbindung koordiniert, möglicherweise durch die ortsspezifische Auslieferung seiner Ladung an definierte Synapsen. Desweiteren wurde eine Rolle für Unc-104 bei der Regulation des Wachstums der NMJ und der Stabilität der dendritischen Äste identifiziert, was auf eine Beteiligung von Unc-104 am dendritischen Transport hindeutet. Zusätzlich konnte eine Veränderung des subsynaptischen Retikulums beobachtet werden. Diese neuen Funktionen zusammen mit der zuvor beschriebenen Rollen hebt die bedeutende Funktion von Kinesin-3 bei der Reifung neuronaler Netzwerke hervor, sowohl während der Embryonalentwicklung als auch später während der Bildung larvaler neuromuskulären Verbindungen und bei der Stabilität der dendritischen Äste. Obwohl die untersuchten Mutationen im Kinesin-3 zu schweren neurologischen Defekten führten, wurde keine Neurodegeneration beobachtet. Zukünftige Arbeiten werden zeigen müssen, ob HSP-assoziierte Mutationen, die erst kürzlich in unc-104 identifiziert wurden, zu ähnlichen neurologischen Defekten wie den von mir beobachteten führen oder ob sie Neurodegeneration auslösen. Desweiteren wurden axonale Transportdefekte untersucht, die durch die ektopische Expression von einer Krankheits-assoziierten Mutation in khc hervorgerufen wurden. Zu diesem Zweck wurde die Mutation N256S im SPG10 Gen kif5a gewählt, von der gezeigt wurde, dass sie die Transportgeschwindigkeit des Kinesins beeinflusst, aber nicht die Mikrotubuliaffinität. Ektopische Expression von Drosophila khc, welche diese humane Mutation trägt, ist ausreichend um axonalen Transport zu stören und motoneuronale Erkrankungen in Drosophila hervorzurufen. Beeinträchtigungen im Transport von Kinesin-1 Frachten führen zu axonalen Schwellungen und Degeneration von Synapsen. Schwerpunkt dieser Studie war es, die ultrastrukturellen Veränderungen, die in diesem SPG10 Modell auftreten zu untersuchen. Axonale Schwellungen sind ein wichtiges zelluläres Kennzeichen der menschlichen Krankheit. In Drosophila khc Nullmutanten können Axone einen bis zu 10-fach größeren Durchmesser aufweisen. Tatsächlich konnte bestätigt werden, dass die ektopische Expression von khcN256S ausreichend ist um axonale Schwellungen hervorzurufen. Interessanterweise reichern sich in den Schwellungen sowohl Frachten des anterograden als auch des retrograden Transports an. Das Vorhandensein großer, autolysosomaler Organellen weist auf eine anhaltende Degeneration hin.

Intact fast anterograde transport is imperative both for proper neurodevelopment as well as to protect synapses against degeneration. In this, study I investigate the diverse effects of mutations in the two major anterograde motors: The kinesin-3 family member Unc-104 and the kinesin-1 family member KIF5A. Interestingly mutations in both motors have been associated with hereditary spastic paraplegia (HSP). HSPs comprise a group of inherited motorneuron diseases. The main feature of HSP is the progressive stiffness of the lower limbs due to a dysfunction of nerve cells. Hereby, the kinesin-3 family member unc-104 is the Drosophila homolog of kif1a, the spastic paraplegia gene 30 (SPG30), the kinesin-1 family member khc is the homolog of kif5a, the SPG10 gene. In an anatomical screen of neurodevelopmental mutants, I identified unc-104bris as a novel mutation in unc-104. unc-104 has been shown to be important for fast axonal transport of synaptic components and maturation of embryonic synaptic boutons. Unc-104bris is a point mutation in a conserved residue (R561H) in the FHA domain of Unc-104. This mutation does not decrease protein abundance but does lead to functional impairment in the unc-104 loss of function mutant, most likely by affecting the regulation of kinesin activity, which is important for energy coupled cargo loading. Using this subtle mutation I was able to uncover novel cellular functions of Unc-104 in Drosophila. I show that Unc-104 coordinates presynaptic maturation of neighboring active zones at the neuromuscular junction, possibly by controlling site specific delivery of its cargoes. Next, I identified a role for Unc-104 in restricting NMJ growth and dendrite branch stability, suggesting the involvement of Unc-104 in dendritic transport. Additionally, changes in the subsynaptic reticulum were observed. These novel functions together with the previously described roles highlight that kinesin-3 function is critically important for the maturation of neuronal structures, both during embryonic development and later during larval neuromuscular junction formation and dendrite branch stability. Although the investigated mutations in the kinesin-3 did cause severe neurodevelopmental defects, no neurodegeneration was observed. Future work will have to show whether HSP associated mutations recently identified in unc-104 lead to a similar neurodevelopmental defects as observed by me, or whether they trigger neurodegeneration. I next investigated axonal transport defects caused by the ectopic expression of disease associated mutations in khc. To this aim the mutation N256S in the SPG10 gene kif5a was selected, which has previously been shown to affect transport velocity but not microtubule binding affinity. Ectopic expression of Drosophila khc carrying this human mutation is sufficient to disturb axonal transport and to induce motoneuron disease in Drosophila. Impairments in the transport of kinesin-1 cargos lead to axonal swellings and neurodegeneration of synapses. Focus of this study was hereby, to investigate ultrastructural alterations that occur in this SPG10 HSP model. Axonal swellings are an important cellular hallmark of the human disease. In Drosophila khc null mutants axons have increased diameter up to ten-fold within a micron. Indeed I was able to confirm that ectopic expression of khcN256S is sufficient to cause the formation of axonal swellings. Interestingly cargo of both anterograde and retrograde transport accumulate inside swellings. The presence of large auto-lysosomes organelles is indicative of ongoing degeneration. Indeed examination of synaptic terminals revealed that while no major developmental disturbances of synapse morphology were observed, dystrophic boutons were frequently detected.