Structural and Functional Analysis of Polyomavirus Attachment to Carbohydrate Receptors

Abstract

Viruses must attach to specific receptors on their host cells in order to initiate entry. Viral spread, tissue and host tropism are determined by precisely regulated contacts and affinities between viral proteins and their cognate ligands at the cell surface. The present thesis focuses on the attachment proteins and receptor interactions of several polyomaviruses, a group of small, non-enveloped double-stranded DNA viruses that infect a range of mammalian and avian hosts. Simian virus 40 (SV40) has been a paradigm for understanding attachment and entry of non-enveloped viruses, viral DNA replication, and virus assembly, as well as for endocytosis pathways associated with cholesterol. It shares high homology with the widespread human polyomaviruses JC and BK (JCV and BKV, respectively), which establish asymptomatic infections in early childhood, but cause disease in immunocompromised individuals. JCV causes the fatal demyelinating disease Progressive Multifocal Leukoencephalopathy through lytic infection of oligodendrocytes, and BKV is a major cause of kidney allograft loss because it gives rise to Polyomavirus-associated Nephropathy and Hemorrhagic Cystitis in transplant recipients. The emerging human polyomaviruses WU and KI (WUV and KIV, respectively) are not linked to disease yet. Polyomavirus capsids consist of 72 pentamers of the major capsid protein VP1, which mediates interactions with cell-surface receptors. These are sialylated oligosaccharides for SV40, JCV and BKV. In this thesis, VP1 pentamers were produced that could not assemble into capsids because of truncations in their C-termini. Glycan array screening of such pentamers revealed that SV40 VP1 recognizes the ganglioside GM1, which carries a branched alpha2,3-linked sialic acid with narrow specificity. The alpha2,6-sialylated pentasaccharide LSTc was identified as a specific receptor motif for JCV VP1. BKV VP1 was shown to attach to b-series gangliosides, which share a common alpha2,8-linked disialic acid motif, by glycan array screening, cell-based infection assays and saturation transfer difference (STD) NMR. The crystal structures of SV40 VP1 in complex with the GM1 oligosaccharide, of JCV VP1 in complex with LSTc, and of BKV VP1 in complex with the oligosaccharide portion of the b-series ganglioside GD3 were determined at 2.25 Å, 2.0 Å and 1.7 Å, respectively. They indicate that carbohydrates are bound in shallow, solvent-exposed grooves at the outer surface of the capsid that are formed by extensive loops of VP1. This is consistent with the relatively low affinity in the millimolar range of one binding site of SV40 VP1 for GM1, which was determined by isothermal titration calorimetry. The three viruses share a common binding site that interacts with the major contact, terminal sialic acid, through a complex network of interactions. The structures of the binding sites suggest that BKV and JCV prefer the human-type sialic acid N-acetyl neuraminic acid (NeuNAc), while SV40 prefers the monkey-type N-glycolyl neuraminic acid (NeuNGc). Specificity for different carbohydrate sequences underlying the sialic acid is determined by a small number of carefully positioned satellite residues. These form relatively few contacts with additional carbohydrate moieties, but enable engagement of the correct ligand while blocking others. Comparison of the SV40 and BKV VP1 structures suggested that their specificities for sialic acid in different linkages were determined by the difference in one amino acid. When the corresponding point mutation K68S was introduced into BKV VP1, its specificity was switched from b-series gangliosides to GM1, as demonstrated by STD NMR and glycan array screening. Moreover, the mutant recognized only GM1 carrying NeuNAc and not NeuNGc, hinting at a role for different sialic acid types in host tropism. Crystal structures of WUV and KIV VP1 were solved at 2.9 and 2.55 Å, respectively. They are distant in evolution from SV40, BKV and JCV VP1 as well as from Murine Polyomavirus (Polyoma) VP1. Comparison of the KIV and WUV VP1 structures with SV40 and Polyoma VP1 revealed a conserved VP1 core and a surprisingly different loop arrangement. However, all four structures feature a stretch of conserved main chain structure in one surface loop, which is at the center of the overlapping SV40 and Polyoma sialic acid binding sites.

Der erste Schritt bei der Infektion einer Zelle durch ein Virus ist das Andocken an einen spezifischen Rezeptor. Die präzise regulierten Kontakte und Bindungsaffinitäten zwischen Virusproteinen und ihren Liganden auf der Zelloberfläche bestimmen die Ausbreitung des Virus, seine Gewebe- und Wirtsspezifität. Diese Arbeit untersucht die Anheftungsproteine verschiedener Polyomaviren sowie deren Wechselwirkungen mit Rezeptoren. Polyomaviren sind eine Gruppe kleiner, unbehüllter Viren mit doppelsträngigem DNA-Genom, die eine Reihe von Säugetieren und Vögeln befallen. Simian Virus 40 (SV40) ist ein Modell zur Erforschung der Virusreplikation, der Andock- und Aufnahmewege von unbehüllten Viren sowie von cholesterinabhängigen Endozytosemechanismen. SV40 ähnelt sehr den weit verbreiteten menschlichen Polyomaviren JC und BK (JCV und BKV), die Menschen in früher Kindheit persistent asymptomatisch infizieren, aber bei geschwächtem Immunsystem Erkrankungen auslösen. JCV verursacht durch lytische Infektion von Oligodendrocyten die tödliche demyelinisierende Krankheit Progressive Multifokale Leukenzephalopathie (PML). BKV ist eine der Hauptursachen für das Scheitern von Nierentransplantationen, da es zu Polyomavirus-assoziierter Nephropathie und hämorrhagischer Cystitis führt. Es ist noch nicht bekannt, ob die neu entdeckten menschlichen Polyomaviren WU und KI (WUV und KIV) Krankheiten verursachen. Polyomavirus-Capside bestehen aus 72 Pentameren des Proteins VP1, welches an Rezeptoren auf der Zelloberfläche bindet. Die Rezeptoren für SV40, BKV und JCV sind Oligosaccharide, die Sialinsäure enthalten. In dieser Arbeit wurden rekombinante VP1 Pentamere mit verkürzten C-Termini produziert, die sich deswegen nicht mehr zu Capsiden assemblieren können. Es wurde mittels Glycanarray-Screening von solchen Pentameren gezeigt, dass SV40 VP1 das Gangliosid GM1 mit hoher Spezifität erkennt, das eine terminale, alpha2,3-verbundene Sialinsäure enthält. Das Pentasaccharid LSTc, das eine terminale, alpha2,6-verbundene Sialinsäure enthält, wurde als spezifisches Rezeptormotiv für JCV VP1 identifiziert. Weiterhin wurde mittels Glycanarray-Screening, zellbasierten Infektionsassays und STD NMR gezeigt, dass BKV an Ganglioside der b-Serie bindet, die alle ein alpha2,8-verbundenes, terminales Disialinsäure-Motiv gemein haben. Die Kristallstrukturen der Komplexe aus SV40 VP1 und dem Oligosaccharid-Anteil von GM1, JCV VP1 und LSTc sowie BKV VP1 und dem Kohlenhydrat-Anteil des b-Serien-Gangliosids GD3 wurden mit 2,25 Å, 2,0 Å und 1,7 Å Auflösung bestimmt. Sie zeigen, dass die Kohlenhydrat-Rezeptoren in flachen, exponierten Mulden auf der Außenseite des Capsids gebunden werden. Diese werden in allen drei Komplexen von langen Loops in VP1 gebildet. Dieser Bindungsmodus ist konsistent mit einer relativ geringen, millimolaren Affinität einer Bindungsstelle auf SV40 VP1 für GM1, die mittels Isothermer Titrationskalorimetrie gemessen wurde. Die drei Viren nutzen dieselbe konservierte Bindungsstelle für ihren Hauptkontakt, terminale Sialinsäure, die sie mittels eines komplexen Netzwerks von Interaktionen erkennen. Die Strukturen der Bindungsstelle lassen eine Präferenz von BKV und JCV für den Sialinsäure-Typ vermuten, der in Menschen am häufigsten vorkommt, nämlich N-Acetyl-Neuraminsäure (NeuNAc). SV40 dagegen scheint die in Affen häufigere N-Glycolyl-Neuraminsäure (NeuNGc) zu bevorzugen. Die Unterscheidung von Sialinsäuren in unterschiedlichen glycosidischen Bindungen bzw. verschiedener mit der Sialinsäure verknüpfter Kohlenhydrate wird durch einige wenige geschickt gelegene Aminosäuren außerhalb der Bindungsstelle für terminale Sialinsäure bewerkstelligt. Obwohl diese nur wenige Kontakte mit dem Oligosaccharid ausbilden, ermöglichen sie die Bindung des korrekten Liganden und blockieren Wechselwirkungen mit anderen Kohlenhydraten. Es wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Spezifitäten von BKV und SV40 für Sialinsäure in verschiedenen Kontexten durch eine einzelne Aminosäure bestimmt wird. Die entsprechende Punktmutation K68S wurde in BKV VP1 erzeugt, was die Spezifität von BKV von Gangliosiden der b-Serie zu GM1 verschob, was mittels STD NMR und Glycanarray-Screening gezeigt wurde. Weiterhin erkennt die Mutante nur GM1 mit NeuNAc, nicht aber mit NeuNGc. Dies deutet darauf hin, dass die Sialinsäuretypen für die Wirtsspezifität von Polyomaviren von Bedeutung sein könnten. Die Kristallstrukturen von WUV und KIV VP1 wurdem mit Auflösungen von 2,9 Å und 2,55 Å gelöst. WUV und KIV sind evolutionär weit entfernt von SV40 und dem murinen Polyomavirus (Polyoma). Ein Strukturvergleich von WUV und KIV mit SV40 und Polyoma zeigte einen konservierten Kern von VP1 und überraschend diverse Loopstrukturen. Alle vier Strukturen enthielten allerdings auch eine konservierte Konformation der Hauptkette in einem Loop auf der Proteinoberfläche, die sich im Zentrum der überlappenden Sialinsäurebindungsstellen von SV40 und Polyoma befindet.