Biochemical Investigations of Aromatic Prenyltransferases from the ABBA Superfamily

Abstract

The linkage of isoprenoid and aromatic moieties, catalyzed by aromatic prenyltransferases (PTases), leads to an impressive diversity of primary and secondary metabolites, including important pharmaceuticals and toxins (e.g. ubiquinone derivatives and ergot alkaloids). In 2005, a hydroxynaphthalene PTase, NphB, featuring a novel ten-stranded b-barrel fold, was identified in Streptomycetes. This fold, termed the PT-barrel, remained exclusive to the NphB family until its recent discovery in the DMATS family of indole PTases. Members of both families exist only in fungi and bacteria, and all investigated members catalyze the prenylation of aromatic substrates in the biosynthesis of secondary metabolites. Sequence comparisons using PSI-BLAST do not yield matches between these two families, suggesting that they could have converged upon the same fold independently. However, in the first chapter of this thesis evidence is provided for a common ancestry for the NphB and DMATS families of PTases. In addition sequence repeats were identified that coincide with the structural repeats in proteins belonging to these two families. Therefore it could be speculated that the PT-barrel arose by amplification of an ancestral aabb module. Because of their homology and their similarities in structure and function, this study proposes to group the NphB and DMATS families together into a single superfamily, the PT-barrel superfamily or ABBA prenyltransferase superfamily. The second chapter of this thesis reports on a phenazine biosynthetic gene cluster which was discovered in Streptomyces tendae Tü1028. In preliminary work the formerly silent phenazine biosynthetic gene cluster was activated by introduction of a constitutive promoter and heterologous expression in Streptomyces coelicolor M512. Subsequently the accumulation of the antibiotic phenazine-1-carboxylic acid (PCA) and of a new derivative thereof, i.e. a conjugate of PCA and L-glutamine (PCA-Gln), was observed. The linkage of PCA to L-glutamine was catalyzed by enzymes of the heterologous expression host Streptomyces coelicolor M512. In this study I investigated the biological activity of PCA-Gln compared to PCA and could show that PCA showed a strong antibiotic effect, but PCA-Gln did not. It could be speculated that glutamination of PCA represents a resistance mechanism against the antibiotic PCA, which is produced in significant quantities in soil by Pseudomonas strains. The gene cluster from S. tendae Tü1028 also contained genes for all enzymes of the mevalonate pathway and for an aromatic PTase, thereby resembling gene clusters for prenylated phenazines. However this study proves by purification and biochemical investigation of the PTase that it does not prenylate phenazines but hydroxynaphthalene substrates, showing very similar properties as NphB of naphterpin biosynthesis. The third chapter of this thesis deals with a new ABBA PTase which farnesylates a benzodiazepine substrate. The bacterium Micromonospora sp. RV115 produces the unusual metabolite diazepinomicin, a prenylated benzodiazepine derivative. Biochemical investigation of the PTase DzmP from this organism showed the farnesylation of the amide nitrogen of dibenzodiazepinone. DzmP is the first member of the ABBA PTase superfamily which utilizes farnesyl diphosphate (C15) as genuine substrate. All previously discovered members utilize either dimethylallyl diphosphate (C5) or geranyl diphosphate (C10). Another putative diazepinomicin biosynthetic gene cluster was identified in the genome of Streptomyces griseoflavus Tü4000. The gene cluster contains a gene ssrg_00986 with 61.4% identity (amino acid level) to dzmP. The purified protein showed similar catalytic properties as DzmP.

Die Verknüpfung von Isoprenketten mit Aromaten, katalysiert von aromatischen Prenyltransferasen (PTasen), erzeugt eine beeindruckende Vielfalt von Primär- und Sekundärmetaboliten, inklusive bedeutender Arzneistoffe und Toxine wie zum Beispiel Ubichinonderivate oder Ergotalkaloide. Im Jahr 2005 wurde eine Hydroxynaphthalin-PTase (NphB) in Streptomyceten gefunden, welche eine neuartige Proteinfaltung mit zehn antiparallelen b-Faltblattsträngen zeigt. Diese Proteinfaltung, genannt das PT-barrel, kam nur in der NphB-Familie vor, bis es vor kurzem ebenfalls in der DMATS Familie von Indol-PTasen gefunden wurde. Mitglieder dieser zwei Familien kommen nur in Pilzen und Bakterien vor und alle bisher untersuchten Vertreter katalysieren die Prenylierung von aromatischen Substraten des Sekundärmetabolismus. Sequenzvergleiche mit PSI-BLAST zeigen keine Ähnlichkeiten zwischen diesen beiden Familien, was zunächst nahe legte, dass sich die Proteinfaltung des PT-barrels in diesen unabhängig entwickelt haben könnte. Im ersten Kapitel dieser Dissertation werden aber Hinweise aufgezeigt, die für einen gemeinsamen Ursprung der NphB- und DMATS-Familien sprechen. Ebenso wurden Sequenzwiederholungen in Vertretern dieser zwei Familien gefunden, die mit den Sekundärstrukturwiederholungen des PT-barrels übereinstimmen. Man kann also annehmen, dass sich die PT-barrel-Faltung aus einer Vervielfältigung eines vorausgegangenen aabb Moduls entwickelt hat. Unter Berücksichtigung ihrer Homologie und der Ähnlichkeit der Proteinfaltung, sowie ihrer Funktion, schlägt diese Arbeit vor, die NphB- und DMATS-Familien in einer Superfamilie zu vereinen, der PT-barrel Superfamilie bzw. ABBA PTase Superfamilie. Das zweite Kapitel dieser Dissertation handelt von einem Phenazinbiosynthese-gencluster, welches in Streptomyces tendae Tü1028 gefunden wurde. In einer vorausgegangenen Arbeit konnte das inaktive Phenazinbiosynthesegencluster durch Einfügen eines konstitutiven Promotors und heterologe Expression in Streptomyces coelicolor M512 aktiviert werden. Dies führte zu einer Produktion des Antibiotikums Phenazin-1-carbonsäure (PCA) und eines Derivates davon, genauer eines Konjugat von PCA mit L-Glutamin (PCA-Gln). Die Verknüpfung von PCA und L-Glutamin durch Bildung einer Amidbindung wird durch Enzyme des heterologen Wirtsstammes Streptomyces coelicolor M512 katalysiert. In dieser Dissertation wird durch biologische Aktivitätsstudien gezeigt, dass PCA eine deutliche antibiotische Wirksamkeit zeigt, nicht jedoch PCA-Gln. Somit scheint die Glutaminierung von PCA einen Resistenzmechanismus gegen das Antibiotikum PCA, welches im Boden in signifikanten Mengen von Pseudomonaden gebildet wird, darzustellen. Das Gencluster aus S. tendae Tü1028 beinhaltet des Weiteren Gene für Enzyme der Mevalonatbiosynthese und eine aromatische PTase (PtfSt), ähnlich zu Genclustern für prenylierte Phenazine. Im Gegensatz dazu wird in dieser Arbeit durch Reinigung und biochemische Untersuchung der PTase gezeigt, dass von diesem Enzym keine Phenazine prenyliert werden, sondern Hydroxynaphthalinsubstrate. Damit zeigt PtfSt Eigenschaften, die sehr ähnlich zu denen von NphB aus der Naphterpinbiosynthese sind. Das dritte Kapitel dieser Dissertation beschreibt eine neuartige ABBA PTase, welche ein Benzodiazepin farnesyliert. Das Bakterium Micromonospora sp. RV115 produziert den ungewöhnlichen Sekundärmetabolit Diazepinomicin, ein prenyliertes Benzodiazepinderivat. Biochemische Untersuchungen der PTase DzmP aus diesem Organismus zeigt eine Farnesylierung des Amidstickstoffs von Dibenzodiazepinon. DzmP ist das erste Mitglied der ABBA PTase-Superfamilie, welches Farnesyldiphosphat (C15) als natürliches Substrat nutzt. Alle bekannten Mitglieder nutzen entweder Dimethylallyldiphosphat (C5) oder Garanyldiphosphat (C10). Ein weiteres mögliches Diazepinomicingencluster konnte in Streptomyces griseoflavus Tü4000 identifiziert werden. Das Gencluster enthält ein Gen (ssrg_00986) mit 61,4% Identität (auf Ebene der Aminosäuren) zu dzmP. Das gereinigte Protein zeigte vergleichbare katalytische Eigenschaften wie DzmP.