Synthetic Modifications of Responsive MRI Contrast Agents-Development of Multifunctional Conjugates for Novel Class of fMRI

Abstract

Magnetic resonance imaging (MRI) using contrast agents has been widely employed in diagnostic imaging and basic research. Mostly to increase MR image contrast, positively Gd3+ based contrast agents are being utilized. In order to better understand biological processes responsive (smart) contrast agents (SCAs) which are able to report physiological changes by altering the MR signal have been developed. To overcome challenges such as localization, quantification, low MR signal etc. during routine in vivo applications of SCAs, one of the strategies is to conjugate such agents to various functional molecules such as dendrimers, nanoparticles, proteins or fluorescent tags. To attach reported SCAs to functional molecules efficient synthetic modifications of such SCAs retaining crucial physico-chemical properties are needed. The first part of thesis describes preparation and characterization of pH sensitive SCAs appended with a phosphonate pendant arm and either an aliphatic (GdL1) or aromatic linker (GdL2). The longitudinal relaxivity of GdL1 and GdL2 increases by 146% and 31%, respectively, when the pH decreases from 9 to 5. These two SCAs were converted to the biotinylated systems GdL3 and GdL4 and their interaction with avidin was investigated. The fluorescence displacement assay and MRI E-titrations revealed a 3:1 binding mode of GdL3–4 to avidin with the binding affinity as high as that of the parent avidin–biotin complex. The high binding affinity was confirmed with MRI by a competitive assay. The avidin–GdL3–4 complexes thus obtained exhibit changes in both r1 and r2 that are pH dependent. The results reveal a new pathway for the modification and improvement of SCAs to make them more suitable for in vivo applications. The second part of thesis presents synthetic modification of a reported Ca2+ responsive bismacrocyclic contrast agent. Modified SCA (Gd2L5) was obtained by inserting an aromatic linking moiety carrying a primary amine group for further derivatization of it. With 1.2 equiv of Ca2+ Gd2L5 exhibited 97% increase in longitudinal relaxivity. This indicates the relaxivity property is well retained in Gd2L5. The amino group from the linker of L5 was converted into an isothiocyanate group to obtain L6 which widens the use of this ligand since its reactive group can be utilized for efficient functionalization of L6. This probe provides a new opportunity to append it to functional molecules suitable for in vivo applications through its linker. The last chapter describes the synthesis of L5 using solid phase synthetic methodology applying pthalamide/tert-butyl chemistry. This is the first report to obtain such a bismacrocycle on solid support. This strategy was attempted to minimize the time consuming laborious purifications of polar intermediates in the liquid phase approach. With the successful demonstration of synthesis of L5, Ca2+ responsive bismacrocyclic ligand L7 carrying two aromatic linkers on each macrocycle has been synthesized. This synthetic strategy should allow to produce a large number of synthetic analogues to get a library of molecules within short time. Moreover, structural modulation on solid phase allows to insert different linkers as well as suitable tags to improve its in vivo applicability. Overall, efficient and easy labeling of DO3A based multi targeted contrast agents with a wide range of functional molecules are possible using the aforementioned strategies. Furthermore, this study provides promising pathways to develop multimodal responsive imaging agents for better biomedical applications.

Die in der Magnetresonanztomographie (MRI) verwendeten Kontrastmittel werden weitestgehend in der Diagnose oder in der Grundlagenforschung als bildgebende Methode eingesetzt. Meistens um den MRI-Kontrast positiv zu verstärken, dabei werden hauptsächlich Gd3+ basierte Systeme verwendet. Um ein besseres Verständnis von biologischen Prozessen zu erhalten, wurden intelligente Kontrastmittel (engl. SCAs: smart contrast agents) entwickelt, welche in der Lage sind physiologische Veränderungen durch Veränderung des MR-Signals sichtbar zu machen. Um die Herausforderungen zu überwinden, welche sich während einer in vivo Routineuntersuchung mit SCAs ergeben, wie die Lokalisierung , Quantifizierung, niedrige MR-Signale etc., besteht eine mögliche Strategie darin, solche Kontrastmittel mit verschiedenen funktionellen Molekülen, wie Dendrimeren, Nanopartikeln, Proteine oder Fluoreszenzmarker, zu verknüpfen. Um an bekannte SCAs funktionelle Moleküle anzuheften, kommt es darauf an bei der Modifizierung solcher SCAs die physikalisch-chemischen Eigenschaften beizubehalten die für deren Funktion essentiell sind. Der erste Teil dieser Dissertation beschreibt die Synthese und die Charakterisierung von pH sensitiven SCAs, an denen entweder ein aliphatischer (GdL1) oder ein aromatischer (GdL2) Linker angeheftet ist, mit angehängten Phosphatarm. Die longitudinale Relaxation von GdL1 und GdL2 wird um 146% beziehungsweise um 31% verstärkt, falls der pH-Wert von 9 auf 5 abnimmt. Diese beiden SCAs wurden zu einem biotinylierten System umgesetzt, GdL3 und GdL4, und deren Wechselwirkungen mit Avidin untersucht. Über die Untersuchungsmethoden, des "fluorescence displacement"-Assay und der MRI E-Titration, konnte ein 3:1 Bindungsmode von GdL3-4 zu Avidin mit einer genauso hohen Bindungsaffinität gezeigt werden, wie bei dem ursprünglichen Avidin-Biotin-Komplex. Diese hohe Bindungsaffinität konnte über einen kompetitiven Assay mittels MRI bestätigt werden. Der Avidin-GdL3-4-Komplex der folglich erhalten wurde, zeigte Unterschiede in r1 als auch r2 im Bezug auf die pH-Abhängigkeit. Diese Ergebnisse zeigen neue Möglichkeiten für die Modifikation und Verbesserung von SCAs um diese geeigneter für die in vivo Anwendung zumachen. Der zweite Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit der Modifikation von bereits beschrieben Ca2+ ansprechbaren bismakrozyklischen Kontrastmitteln. Das modifizierte SCA (Gd2L5) wurde über die Insertion von aromatischen Linkern erhalten, die funktionelle Gruppen mit primären Aminen tragen, die für eine weitere Derivatisierung geeignet sind. Mit 1.2 Äquivalenten an Ca2+ konnte gezeigt werden, dass Gd2L5 eine um 97% höhere longitutinalen Relaxation erreicht. Dies deutet daraufhin, dass die Eigenschaften für die Relaxation in Gd2L5 gut erhalten blieben. Die Aminogruppe des Linkers L5 wurde außerdem in eine Isothiocyanat-Gruppe umgewandelt und so L6 erhalten. Dies erweitert die Nutzung der Liganden, da die reaktive Gruppe dazu genutzt werden kann, um zu einer effizienten Funktionalisierung von L6 zu führen. Diese Sonde bietet neue Möglichkeiten, diese an funktionelle Moleküle anzuheften, welche geeignet sind für eine in vivo Anwendung mit Hilfe der Linker. Im letzten Kapitel wird die Synthese von L5 beschrieben, wobei eine Methode der Festphasensynthese angewendet wurde, benutzt wurde dabei die Phthalamid/tert-Butyl-Chemie. Dies ist der erste Bericht bei dem Bismakrozyklen mit Hilfe einer Festphasenmethode erhalten wurden. Diese Strategie wurde angewandt um den Zeitaufwand zu minimieren, welcher durch die Aufreinigung von polaren Intermediaten in wässriger Phase anfällt. Nach der erfolgreich demonstrierten Synthesen von L5, wurde der Ca2+ ansprechbare bismakrozyklische Ligand L7, der zwei aromatische Linker an jedem Makrozyklus trägt, erfolgreich synthetisiert.. Diese Synthesestrategie erlaubt es prinzipiell innerhalb einer kurzen Zeit eine große Anzahl analoger Moleküle zu synthetisieren und so eine Molekülsammlung zu erstellen. Zudem erlaubt die strukturelle Modifikation an der Festphase die Insertion verschiedener Linker, sowie das Anbringen geeigneter Marker um die in vivo Anwendung zu verbessern. Insgesamt sind effiziente und leicht markierbare DO3A basierte "multi-targeted"-Kontrastmittel mit einem weiten Bereich von funktionellen Molekülen möglich, unter Nutzung der vorher erwähnten Strategien. Desweiteren bietet diese Studie vielversprechende Synthesewege an, für die Entwicklung von multimodular ansprechbaren Kontrastmitteln, für eine bessere biomedizinische Anwendung.