Potassium Channels and Growth Control: Identification and Characterisation of Mutations Affecting Proportional Growth of the Fin in the Cyprinid Danio rerio

Abstract

Growth plays an essential role during development, as it provides the raw material upon which morphogenesis and cell differentiation can act. For an organism to achieve final shape and the right proportions between its body parts, such process has to be highly coordinated. However, to date, only very little is known about how growth and organ size are regulated. In this study, I used a forward genetic approach in the zebrafish Danio rerio to identify genes that can affect organ size and alter proportional growth. I analysed several N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) induced adult viable mutants that develop enlarged fins. Through positional cloning I show that two of these, another longfin (alf) and pfau, bear a missense mutation in kcnk5b, a gene encoding for a 2-pore domain potassium (K+) channel. The altered protein residues affect transmembrane domains of the channel and electrophysiological assays in Xenopus oocytes indicate that these mutations cause an increase in K+ conductance, which leads to hyperpolarisation of the membrane potential (Vm) in ovo. Transplantation experiments suggest that the mutations in kcnk5b act within the fin tissues. By misexpression in somatic clones, I prove that the mutant channel is sufficient to promote local growth of the fin. A second class of mutations, which cause a specific overgrowth of the dorsal fin in the mutants segel (sgl), segel-like (sllk) and flagge (fgg), was identified as harbouring defects in another K+ channel encoding gene, kcnh1a. The independent isolation of several fin overgrowth mutants that all alter the function of K+ channels suggests that ion channels play an important role in organ growth and fin size determination in the zebrafish. In this context, it will be interesting to consider whether K+ channels play a major role in size regulation also in fish species where exaggerated fin growth is occurring naturally. Preliminary data from poecilid species displaying sex-specific fin enlargement presented in this work support this notion.

Wachstum spielt während der Entwicklung eine zentrale Rolle, da es die Grundlage für Morphogene˙se und Zelldifferentierung schafft. Um die endgültige Form eines Organismus zu erreichen und die richtigen Proportionen zwischen dessen Körperteilen zu gewährleisten, muss dieser Vorgang bis ins Detail koordiniert werden. Bis heute weiß man nur sehr wenig darüber, wie die Größe eines Organs bestimmt wird. In der vorliegenden Arbeit habe ich anhand klassischer Mutagenese im Zebrabärbling Danio rerio Gene identifiziert, welche die Dimension eines Organs beeinflussen und zu wachstumsbedingten Veränderungen der Proportionen führen. Ich analysiere hier unterschiedliche N-Ethyl-N-nitrosourea (ENU) induzierte, adult-lebensfähige Mutanten, welche vergrößerte Flossen zeigen. Durch positionelle Klonierung, konnte ich für zwei dieser Mutanten, another longfin (alf ) und pfau, die eine Vergrößerung von Flossen und Barteln vorweisen, zeigen, dass diese eine nicht-synonyme Mutation in kcnk5b tragen, einem Gen, welches für einen 2-Porendomänen Kaliumkanal codiert. Die betroffenen Aminosäuren befinden sich in den Transmembrandomänen des Kanals. Elektrophysiologische Analysen in Xenopus Oozyten zeigen, dass dies zu einer Zunahme des elektrischen Leitwerts für Kaliumionen führt. Dies führt zu einer Hyperpolarisierung des Membranpotentials (Vm) der Oocyte. Transplantationsexperimente weisen darauf hin, dass diese Mutationen in der Flosse selbst agieren. Durch Missexpression der mutanten Version des Kanals in somatischen Klonen, zeige ich dass die Mutation in kcnk5b ausreichend ist, um lokales Flossenwachstum zu verursachen. Ferner wurden die drei Mutanten segel (sgl), segel-like (sllk ) and flagge (fgg) untersucht, welche vergrößerte Rückenflossen entwickeln. Die hier vorgelegten Indizien, deuten darauf hin, dass diese Mutanten Defekte im spannungsabhängigen Kaliumkanal Kcnh1a haben. Die unabhängige Isolierung mehrerer Flossenmutanten, die alle Defekte in Kaliumkanälen vorweisen, weist darauf hin, dass Ionenkanäle eine wichtige Rolle in der Kontrolle des Flossenwachstums des Zebrabärblings spielen. In diesem Zusammenhang wird es interessant sein zu prüfen, ob Kaliumkanäle an der Größensteuerung von jenen Fischarten beteiligt sind, die sich durch ausgeprägtes Flossenwachstum auszeichnen. Vorläufige Befunde aus lebendgebärenden Zahnkarpfen mit geschlechtsspezifischem Flossenwachstum, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, weisen in diese Richtung.