Structure-Function Analyses of Two-Component Signaling in Arabidopsis Thaliana and Cellular Attachment Mechanisms of Adenovirus Type 37

Abstract

This thesis investigates the structural and functional basis of the plant two-component system and the cellular attachment of Ad37. In case of the plant two-component system, the crystal structure of AHK5RD-AHP1 provided for the first time insight into the binding and phosphoryl transfer mechanism of the sensor HK AHK5 to its downstream signaling partner, AHP1. Analysis of the binding interface in combination with sequence comparison of AHP1 to the remaining AHP proteins in A. thaliana suggested that AHK5 would be able to engage any of the AHP proteins in a similar fashion. SPR analyses confirmed that AHK5RD indeed binds AHP1-3 with similar, micromolar affinity in vitro. In planta, however, BiFC studies revealed differences in the AHK5RD-AHP interaction strength. This indicates the presence of (yet unknown) additional molecular mechanisms that modulate the AHK5RD-AHP interaction in planta. Together with the established SPR protocol the structural analysis of the AHK5RD-AHP1 complex provides a firm basis for further characterization of signaling in plant TCSs. The discovery of the GD1a glycan as cellular receptor for Ad37 led to the determination of the crystal structure of the Ad37-GD1a complex. In this structure, the branched GD1a glycan docks with its two terminal sialic acid residues into two of three binding sites in a central cavity on top of the Ad37 fiber knob. This symmetry mismatch in binding, i. e. having three possible binding sites but only a bivalent receptor, was exploited to design the trivalent inhibitor ME0322. The ME0322 compound carries three branches, each decorated with a terminal sialic acid residue, and it thus engages all three binding sites simultaneously in the Ad37-ME0322 crystal structure. Binding, infection and biological competition experiments then demonstrated the potency of ME0322. In subsequent cycles of structure-based inhibitor design, the scaffold of the conjugate and the sialic acids were modified in order to increase the affinity of follow-up inhibitors. Taken together, structure-based drug design of trivalent inhibitors serves as excellent platform for the development of potent antiviral drugs to combat Ad37 and other EKC-causing Ads.

Diese Doktorarbeit untersucht die strukturelle und funktionelle Grundlage des pflanzlichen Zweikomponenten-Systems und der zellulären Bindung von Ad37. Im Fall des pflanzlichen Zweikomponenten-Systems gewährte die Kristallstruktur von AHK5RD-AHP1 zum ersten Mal Einblick in den Mechanismus der Bindung und der Phosphorylgruppen-Übertragung der Sensor HK AHK5 zu ihrem nachgeschalteten Partner in der Signalübertragung, AHP1. Die Analyse der Interaktionsfläche in Kombination mit Sequenzvergleichen von AHP1 zu den übrigen AHP Proteinen in A. thaliana legte nahe, dass AHK5 in der Lage sei jedes der AHP Proteine auf ähnliche Weise zu binden. SPR-Analysen bestätigten, dass AHK5 tatsächlich AHP1-3 in vitro mit ähnlicher, micromolarer Affinität bindet. BiFC-Studien in planta zeigten jedoch Unterschiede in der Interaktionsstärke der AHK5RD-AHP Komplexe. Die deutet auf die Anwesenheit weiterer (noch unbekannter) molekularer Mechanismen hin, die die AHK5RD-AHP1 Interaktion in planta beeinflussen. Zusammen mit dem etablierten Protokoll für SPR-Messungen bietet die Strukuranalyse des AHK5RD-AHP1 Komplexes eine verlässliche Grundlage für eine weitergehende Charakterisierung der Signalübertragung in pflanzlichen Zweikomponenten-Systemen. Die Entdeckung von GD1a als zellulärem Rezeptor für Ad37 führte zur Bestimmung der Kristallstruktur des Ad37-GD1a Komplexes. In dieser Struktur bindet das verzweigte GD1a Glykan mit seinen zwei terminalen Sialinsäure-Resten in zwei der drei Bindestellen in einer zentralen Einstülpung oben auf dem Ad37 Fiber. Diese symmetrische Diskrepanz im Bindeverhalten, d. h. das Vorliegen von drei Bindestellen aber einem nur zweiwertigen Rezeptor, wurde ausgenutzt den dreiwertigen Inhibitor ME0322 zu entwerfen. ME0322 besitzt drei Arme, jeder ist mit einer terminalen Sialinsäure bestückt, und es besetzt daher in der Ad37-ME0322 Kristallstruktur alle drei Bindestellen auf einmal. Binde -, Infektions -, und biologische Kompetitions-Experimente zeigten die Wirksamkeit von ME0322. In darauffolgenden Zyklen strukturbasierten Inhibitor-Designs wurde das Gerüst des Konjugates sowie die Sialinsäuren modifiziert um die Affinität nachfolgender Inhibitoren zu erhöhen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass strukturbasiertes Wirkstoffdesign dreiwertiger Inhibitoren eine exzellente Plattform für die Entwicklung wirksamer, antiviraler Medikamente darstellt, um Ad37 und andere EKC-auslösende Adenoviren zu bekämpfen.