Funktionelle Charakterisierung von Zellsubpopulationen aus dem Periost anhand magnetischer Zellseparationen

Abstract

Tissue Engineering Anwendungen im Bereich der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie bieten eine geeignete Alternativtherapie zu der Standardtherapie der autologen Knochentransplantation für die Regeneration von Knochendefekten. Hierzu ist neben geeigneten Trägermaterialien sowie Differenzierungsfaktoren eine mesenchymale Stammzellquelle für die Besiedelung der Konstrukte nötig. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) finden sich im menschlichen adulten Körper in nahezu allen Gewebearten. Als eine der gängigsten Quellen hat sich das Knochenmark etabliert. Ebenso befinden sich osteogene Vorläuferzellen in der Knochenhaut (Periost), die in vivo den Aufbau von neuem Knochen verantwortet. Durch die leichtere Zugänglichkeit sowie die Funktionalität bietet das Kieferperiost im Vergleich zum Knochenmark eine geeignetere Quelle für MSCs im Anwendungsbereich der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie an. Da sich die unterschiedlichen Zellschichten der humanen Knochenhaut nur sehr schwer trennen lassen, ist es eine Herausforderung, für die osteogenen Vorläuferzellen aus der Kambiumschicht geeignete Marker zu identifizieren, um nur diese aus dem Gesamtverband zuverlässig isolieren zu können. Verschiedene spezifische Oberflächenmarker für MSCs wurden bereits beschrieben, darunter CD90, CD73, CD105, CD271, Stro-1 und MSCA-1. Letzterer definiert eine Subpopulation aus der Kieferknochenhaut mit höherem osteogenen Potenzial. Da die gängige und gut etablierte Standardmethode der magnetischen Zellseparation (MACS) sowie die durchflusszytometrische Zellsortierung meist recht hohe Mortalitätsraten mit sich ziehen, besteht der Bedarf einer schonenderen Alternativmethode für die Zellseparation. Dafür muss jedoch der genaue, detaillierte Vergleich verschiedener Separationsmethoden gezogen werden. Mit Hilfe von magnetisch markierten MSCA-1 Antikörper wurden in der vorliegenden Arbeit zwei magnetische Separationsmethoden verglichen und daraufhin untersucht eine möglichst reine MSC-haltige Subpopulation aus der heterogenen Periostzellkultur zu isolieren. Neben der etablierten MACS-Methode, die auf einem Säulenprinzip beruht wurde eine weitere magnetische Zellseparationsmethode (EasySep) untersucht, bei der weniger Scherkräfte entstehen. Diese beiden Separationsmethoden wurden in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal vergleichend auf ihre Zellausbeuten, Mortalitätsraten, Zellreinheit und das Beibehalten der Differenzierbarkeit untersucht. Beide untersuchten Methoden unterschieden sich signifikant bezüglich der resultierenden Überlebensraten: dabei zeigte die EasySep Methode signifikant niedrigere Mortalitätsraten (20,32%; MACS: 41,98%). Mithilfe von durchflusszytometrischen Analysen konnte jedoch gezeigt werden, dass die MACS separierten Fraktionen die höhere Reinheit aufwiesen: während der Anteil an MSCA-1+ Zellen in der Positivfraktion bei etwa 45% lag, betrug der Anteil MSCA-1+ Zellen in der entsprechenden Ea-sySep separierten Fraktion nur 19%. Überraschenderweise zeigte die EasySep separierte Negativfraktion einen höheren Anteil an MSCA-1+ Zellen. Weiterhin konnte nur für die MACS Methode eine höhere Mineralisationskapazität der MSCA-1+ Frak-tion im Vergleich zur Negativkontrolle nachgewiesen werden, wohingegen die Fraktionen von EasySep keine Unterschiede in Bezug auf das osteogene Differenzierungspotential zeigten. Die Untersuchung der mitochondrialen Aktivität ergab signifikante Unterschiede nur in den MACS separierten Fraktionen nach osteogener Stimulation. Im Laufe der in vitro Passagierung zeigten die Zellfraktionen beider Methoden eine Abnahme der Mineralisations- und Proliferationskapazität sowie eine ansteigende Seneszenz. Betrachtet man diese Ergebnisse und bringt sie in Verbindung mit den untersuchten Genen und Proteinen, so kommt man zu dem Schluss, dass die MACS Methode eine für Tissue Engineering Anwendungen besser geeignete MSCA-1+ Subpopulation aus der heterogenen Periostzellkultur isoliert. Die für die Zellen schonendere, aber weniger effiziente EasySep Methode brachte keine überzeugenden Resultate ein.

Tissue engineering applications in the field of oral and maxillofacial surgery provide a suitable alternative to the standard therapy of autologous bone transplantation for the regeneration of bone defects. Besides the need of suitable scaffolds and differentiation factors an adequate source of mesenchymal stem cells is required for seeding of the developed constructs. In the human body mesenchymal stem cells (MSCs) are found throughout almost all kinds of tissue. Bone marrow is up to date the best-established source of MSCs. Osteogenic progenitors are also found within the periosteum being responsible for the in vivo new bone formation. Due to the better acces-sibility and the high functionality, periosteum tissue represents a suitable source of MSCs for bone regeneration issues in the oral and maxillofacial surgery compared to bone marrow. Due to the fact that the different layers of jaw periosteum are hardly to separate, the identification of suitable markers for the reliable isolation of osteoprogenitors from the whole tissue poses a challenge. Different surface markers of MSCs have already been described, such as CD90, CD73, CD105, CD271, Stro-1 and MSCA-1. The latter one defines a subpopulation of the jaw periosteum eliciting a higher osteogenic potential. The well-established standard method for magnetic cell separation (MACS) shows high mortality rates. Therefore the establishment of a gentler alternative for cell separation and a detailed and exact comparison of different methods are required. In the present work two magnetic separation methods using specific MSCA-1 antibodies were compared regarding the isolation of a pure MSC-containing subpopulation from the heterogeneous population of the jaw periosteum. Besides the use of the well-established MACS separation method based on a column set-up, a second magnetic cell separation method (EasySep) providing a set-up with lower shearforces was performed. Both separation methods have been compared regarding cell yields, mortality rates, cell purities and the ability to differentiate into osteogenic tissue. The analyzed methods showed significant differences regarding the cell viability: the EasySep approach showed significant lower mortality rates (20.32% in comparison to 41.98% by MACS). Using flow cytometric analysis we provided evidence that MACS isolated cell fractions showed the higher purities: in the MACS separated MSCA-1positive cell fraction we detected 45% MSCA-1+ cells, whereas the EasySep fraction contained only 19% MSCA-1+ cells. Surprisingly, the negative fraction of EasySep showed the higher amount of MSCA-1+ cells. The MACS separated MSCA-1+ fraction revealed a significant higher mineralization capacity compared to the negative fraction, whereas the EasySep separated fractions showed no differences regarding the osteogenic potential. We detected significant differences considering the mitochondrial activity designating the proliferative capacities of cells only in MACS separated fractions after osteogenic stimulation. During in vitro passaging of the isolated cell fractions a decrease of the mineralization and proliferation capacities of cells and an increase in cell senescence was observed independent from the separation method. Considering these results and those analyzed by gene and protein expression, we can conclude that the MACS method provides the more suitable approach to isolate a pure MSCA-1+ subpopulation from the heterogeneous jaw periosteum for tissue engineering applications in the oral and maxillofacial surgery. The gentler but less efficient EasySep method yielded no convincing results.