Einfluss von Hitzeschockproteinen auf die MHC-II vermittelte T-Zellantwort - Identifizierung einer molekularen Bindestelle zwischen Hsp70 und HLA-DR

Abstract

Hitzeschockproteine (HSPs) sind eine große Gruppe hoch konservierter, intrazellulärer Proteine, die ubiquitär vorkommen und ihrer Größe nach in verschiedene Familien eingeteilt werden. Hitzeschockproteine sind in erster Linie für die intrazelluläre Chaperonierung von Proteinen bei Stress verantwortlich, helfen aber auch bei der Faltung, Entfaltung oder beim Abbau von Proteinen. Sie spielen aber auch eine Rolle in der Immunabwehr. So sind zum Beispiel Hitzeschockprotein 70 (Hsp70):Peptid Komplexe in der MHC-I und MHC–II vermittelten Antigenpräsentation involviert. In der vorliegenden Arbeit sollte die Bedeutung des Hsp70 bei der Chaperonierung antigener Peptide und der daraus resultierenden verstärkten Proliferation von antigenspezifischen CD4+ Lymphozyten näher charakterisiert werden. Zunächst wurde der Frage nachgegangen, ob die Chaperonierung von antigenen Peptiden mit Hsp70 zu einer verstärkten Aufnahme in antigenpräsentierende Zellen führt. Dazu wurden Monozyten mit humanem Hsp70 und FITC-markierten Peptiden von Tetanustoxin (TT974-966) oder Peptid alleine inkubiert und die Aufnahme über mehrere Stunden hinweg durchflusszytometrisch untersucht. Es konnte jedoch keine schnellere oder erhöhte Aufnahme von Hsp70:Peptid-Komplexen festgestellt werden. Es erfolgten Untersuchungen mittels konfokaler Mikroskopie um die intrazelluläre Lokalisation der Peptide zu überprüfen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sich die markierten Peptide nach 3 Stunden in späten Endosomen innerhalb der Zelle befinden. Die molekularbiologischen Untersuchungen einer Interaktion von HLA-DR und Hsp70 bilden den zweiten Teil dieser Arbeit. Mit Hilfe von Sequenzvergleichen wurden die für eine Substratbindung wichtigen Aminosäuren im humanen Hsp70 identifiziert und zielgerichtet mutiert. Weiterhin wurde eine Deletion der C-terminalen Domäne durchgeführt. In quantitativen Bindungsassays (DELFIA) wurden die verschiedenen Mutationen dann hinsichtlich ihrer Bindungsaktivitäten getestet. So wurde gezeigt, dass eine Mutation in der Substratbindedomäne von Alanin 405 zu Glycin zu einem Verlust der Substratbindeaktivität führt, während sowohl eine Mutation vom Valin 437 zu Glycin als auch die Deletion der C-terminalen Domäne keinen Einfluss auf die Substratbindung hatten. Eine Bindung aller Mutanten an HLA-DR blieb allerdings unverändert im Vergleich zum Wildtyp Hsp70. Eine Bindung von Hsp70 an HLA-DR zeigte sich als substratunabhängig. Als potentielle Bindestellen an HLA-DR konnte der C-Terminus und die Substratbindedomäne von Hsp70 ausgeschlossen werden. Die Interaktion zwischen HLA-DR und Hsp70 liegt vermutlich im Bereich der ATPase Domäne von Hsp70. Das Vorhandensein einer alternativen Bindestelle von HLA-DR an Hsp70 außerhalb der Substratbindedomäne ermöglicht eine direkte Übertragung eines Hsp70-chaperonierten Peptides in die Bindegrube von HLA-DR. Die erleichterte Beladung von MHC-II Molekülen führt zu einer effektivere Präsentation an der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen, die eine verstärkte Proliferation von antigenspezifischen CD4+-T-Lymphozyten zur Folge hat.

Heat-shock proteins are, next to their houskeeping-functions, involved in the immunrespose. In this work, the immportance of Hsp70 in the uptake of antigen peptides and thus resulting proliferation is further characterized. Furthermore sequences of Hsp70 from different species have been analyzed to characterize the most homologus aminoacids. In bindingassays, the importance of several aminoacids and structural parts of Hsp70 have been tested in respect of binding capacity. It could be shown, that an alternativ binding area exists which leads to a faster interaction between Hsp70-chaperoned antigenic peptides and subsequently leading to a higher proliferatio of T-cells.