Mechanisms of Small RNA Biogenesis in Drosophila

Abstract

Eukaryotic organisms utilise small RNAs to control many biological processes including gene regulation, chromatin modifications and genome protection from threats like viruses or transposons. Small RNAs are distinguished based on their biogenesis mechanisms and associating Argonaute protein partners into three major classes: microRNAs (miRNAs), small interfering RNAs (siRNAs), and Piwi-interacting RNAs (piRNAs).

In Drosophila, miRNAs and siRNAs derive from double-stranded RNA and associate with AGO-clade Argonaute proteins, AGO1 and AGO2. These two small RNA classes share similar processing intermediates, small RNA duplexes, but differ significantly in their biological mode of action. Therefore, pairing of miRNAs and siRNAs with specific Argonaute proteins must be tightly controlled through a process known as “sorting”. Previous models suggested independent pathways to direct miRNAs and siRNAs into AGO1 and AGO2, respectively. The first part of this thesis provides evidence contrary to those models. First, a novel isoform of the dsRNA-binding protein Loqs (normally associated with miRNAs) was identified that is crucial for processing of endogenous siRNAs. Second, an unexpected association of AGO2 with miR* strands was revealed through profiling of bound small RNAs. Taken together, our data indicates a greater flexibility and inter- connection between the two pathways, with small RNAs being sorted based on their intrinsic duplex structures. Based on these results, we extracted and experimentally tested a hierarchy of determinants that governs small RNA sorting in Drosophila. These sorting rules were then applied to design efficient short hairpin RNAs (shRNAs) for artificial gene silencing, with the goal of generating a genome-wide shRNA library for Drosophila.

The third Drosophila small RNA class, piRNAs, associate with members of the PIWI subfamily of Argonaute proteins: Piwi, Aub and AGO3. Despite intense efforts, limited progress has been made in recent years to uncover the biogenesis and effector mechanisms of piRNAs. In particular, the production of primary piRNAs is poorly understood. The second part of this thesis aims to address this question. First, shutdown was identified as novel biogenesis factor of primary and secondary piRNAs. To uncover missing piRNA pathway components, an innovative, transcriptome-wide RNAi screen was carried out in germ cells of the Drosophila ovary. The screen revealed dozens of new genes that impact piRNA biogenesis, transposon silencing and female fertility.

Eukaryonten steuern eine Vielzahl biologischer Prozesse wie die Regulation der Genexpression, die Änderung der Chromatinstruktur und die Sicherstellung der Genomstabilität mittels kleiner regulatorischer RNAs. Kleine RNAs werden anhand ihrer Biogenese-Mechanismen und dem Argonaute Protein, an welches sie binden, in drei Hauptklassen unterteilt: MicroRNAs (miRNAs), kleine interferierende RNAs (engl. small interfering RNAs, siRNAs) und Piwi-interagierende RNAs (engl. Piwi-interacting RNAs, piRNAs).

Die etwa 22 bis 23 Nukleotid (nt) langen miRNAs sind ubiquitär exprimiert, werden von Drosha/Pasha und Dcr1/Loquacious Protein-Komplexen aus Vorläufer-Molekülen mit lokaler doppelsträngiger RNA (dsRNA) prozessiert, und binden in Drosophila überwiegend an AGO1. Dagegen werden die ungefähr 21 nt langen siRNAs aus langer dsRNA, die endogenen oder exogenen Ursprungs sein kann, von Dcr2 hergestellt und binden an AGO2. Obwohl die Biogenese von miRNAs und siRNAs unterschiedliche Faktoren erfordert, besitzen sie ähnliche Zwischenprodukte. Ihnen gemeinsam sind kleine RNA Duplexe. Da sich beide Klassen kleiner RNAs jedoch deutlich in ihren biologischen Wirkungsweisen unterscheiden, muss die Assoziation von miRNAs und siRNAs mit den spezifischen Argonaute Proteinen strikt reguliert sein. Dieser Prozess wird auch als „Sortierung“ (engl. „sorting“) bezeichnet. Aufgrund früherer Daten wurde vorgeschlagen, dass die Duplexstruktur die Sortierung entscheidend beeinflusst und Duplexe mit perfekter dsRNA mit AGO2 assoziieren, wohingegen Duplexe mit mehreren ungepaarten Basen überwiegend in AGO1 geladen werden. Der erste Teil dieser Arbeit belegt, dass die Biogenese von miRNAs und siRNAs entgegen früherer Annahmen stärker verknüpft ist als vermutet und bestehende Modelle für die Sortierung von kleinen RNAs stark vereinfacht sind. Die vorliegende Arbeit charakterisiert eine neuartige Isoform des dsRNA-Bindeproteins Loquacious, welches bisher nur für die Produktion von miRNAs bekannt war. Diese Isoform ist entscheidend an der Herstellung aller untersuchter Typen von endogenen siRNAs beteiligt.

Als nächstes wurde mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung von AGO1- und AGO2-Immunoprezipitaten gezeigt, dass miR Stränge an AGO1 binden, während miR* Stränge, die ursprünglich für reine Nebenprodukte der miRNA Biogenese gehalten wurden, völlig unerwartet mit AGO2 assoziieren. Da beide Stränge eines miRNA Vorläufermoleküls in unterschiedliche Argonaute Proteine geladen werden, kann die Duplexstruktur jedoch nicht alleine für die Sortierung verantwortlich sein. Unsere Daten belegen vielmehr, dass kleine RNAs auf Grund mehrerer Parameter auf beide Argonaute Proteinen verteilt werden. Basierend auf unseren Ergebnissen haben wir diese Parameter extrahiert und eine Rangordnung aufgestellt, welche schließlich experimentell getestet wurde. Zuletzt wurden diese validierten Sortierungs-Parameter verwendet, um effiziente shRNAs (engl. short hairpin RNAs) – künstliche molekulare Werkzeuge zur gezielten Abschaltung jedes beliebigen Gens – für Drosophila zu entwickeln. Ein weiteres Ziel war die Herstellung einer genomweiter shRNA-Bibliothek zur Durchführung von Hochdurchsatz-Screenings.

Die dritte Klasse kleiner RNAs, die piRNAs, sind in Zellen der Keimbahn exprimiert, etwa 23 bis 28 nt lang und assoziieren mit PIWI Proteinen. Drosophila besitzt drei Proteine der PIWI-Familie: Piwi, Aub, und AGO3. Im Gegensatz zu miRNAs und siRNAs werden piRNAs aus einzelsträngigen Vorläufermolekülen produziert. Trotz intensiver Bemühungen in den letzten Jahren wurden nur begrenzte Fortschritte gemacht, um die Biogenese und Wirkmechanismen von piRNAs genau aufzuklären. Insbesondere über die Herstellung der primären piRNAs ist wenig bekannt. Der zweite Teil dieser Arbeit zielt darauf ab, dieses Problem anzugehen. Zuerst wurde Shutdown als neuer Faktor für die Biogenese von primären und sekundären piRNAs identifiziert. Um weitere, bisher in Drosophila nicht bekannte Faktoren zu finden wurde ein innovativer auf RNA Interferenz basierendes Screening durchgeführt. Dabei wurde untersucht, welchen Effekt die gezielte Abschaltung („Gen-Knockdown“) jedes einzelnen der circa 8,400 in den Keimzellen der Ovarien exprimierten Gene auf die Repression von Transposons oder die weibliche Fruchtbarkeit haben. Dieser Screen führte zur Identifizierung Dutzender neuer Gene welche die Biogenese von piRNAs und ihre Wirkmechanismen beeinflussen.