Structural Analysis of Serine/Threonine Protein Kinase B and Multiple Peptide Resistant Factor of Staphylococcus aureus

Abstract

Staphylococcus aureus (S. aureus) infections are becoming increasingly problematic. The bacteria gain resistance to new antibiotics in relatively short time periods. Besides the hospital associated methicillin-resistant S. aureus (HA-MRSA), infections with community-associated MRSA (CA-MRSA) are increasing. The only serine/threonine kinase PknB of S. aureus is composed of an intracellular kinase domain, a transmembrane helix and three extracellular penicillin-binding protein and serine/threonine kinase associated (PASTA) domains. PknB is able to perform phosphorylation and autophosphorylation in vitro. Transcriptome and functional analysis of S. aureus showed that PknB is involved in regulating purine/pyrimidine synthesis, cell wall metabolism and central metabolic functions. In peptide arrays using eukaryotic peptides and PknB, the kinase was identified to be a proline-directed kinase. The crystal structure of the S. aureus PknB kinase domain (PknBSAKD) was solved in complex with a non-hydrolyzable adenosine triphosphate (ATP) analog at 3.0 Å resolution. Different ATP analogs, divalent cations and crystallization techniques were tested to improve crystal quality. The PknBSAKD structure was compared to different eukaryotic and prokaryotic serine/threonine protein kinases. Similar to the full-length protein, PknBSAKD is able to perform phosphorylation and autophosphorylation in vitro. In contrast to the active state in solution, the kinase crystallized in an inactive conformation. The multiple peptide resistant factor (MprF) is a virulence factor of S. aureus. MprF is predicted to be composed of a large hydrophobic region, containing 14 transmembrane segments (TMS) and a hydrophilic C-terminal region. The hydrophilic portion and the six C-terminal TMSs form a synthase domain; the eight N-terminal TMSs harbor a flippase function. The synthase adds lysine to phosphatidylglycerol (PG); the flippase inserts this positively charged lysyl-phosphatidylglycerol (Lys-PG) into the outer membrane leaflet of S. aureus. This leads to a change in the membrane charge, and host defensins are thus no longer able to bind to the bacterial membrane. In this work, the initial constructs of the synthase of MprF contained all the C-terminal soluble part with varying N-terminal ends. In addition to the variations in the N-terminal end of the soluble part, the number of TMSs was varied. All these constructs were successfully cloned and expressed. Protein analysis indicated aggregation of the proteins. The linker region between the last TMS and the soluble part was in the main focus. Variations of only few amino acids influenced the behavior of the protein during purification. Inclusions of increasing numbers of N-terminal TMSs into the construct lead to a decrease in solubility.

Infektionen mit Staphylococcus aureus (S. aureus) werden problematischer, da die Bakterien in immer kürzerer Zeit Resistenzen gegen neue Antibiotika entwickeln. Zusätzlich zur steigenden Anzahl von im Krankenhaus erworbenen Infektionen mit Methicillin resistenten S. aureus Stämmen (HA-MRSA) häuft sich die Anzahl der MRSA Fälle in der nicht hospitalisierten Bevölkerung (CA-MRSA). S. aureus besitzt eine einzige Serin/Threonin Proteinkinase. Diese besteht aus einer intrazellulären Kinasedomäne, einer Transmembranhelix und drei extrazellulären penicillin-binding protein and serine/threonine kinase associated (PASTA) Domänen. PknB ist dazu in der Lage sowohl andere Proteine als auch sich selbst in vitro zu phosphorylieren. Transkriptom- und Funktionalitätsstudien zeigten, dass S. aureus PknB an Regulation der Purin-/Pyrimidin-Synthese, dem Zellwand Metabolismus und zentralen metabolischen Funktionen beteiligt ist. Spezifitätsbestimmungen mittels Micorarrays, bei denen PknB und eukaryotische Peptide verwenden wurden, konnten zeigen, dass es sich bei PknB um eine prolingelenkte Kinase handelt. Die Kristallstruktur der Kinasedomäne von S. aureus PknB (PknBSAKD) wurde im Komplex mit einem nichthydrolysierbaren ATP (Adenosintriphosphat) Analogon bei einer Auflösung von 3.0 Å gelöst. Um die Kristallqualität zu verbessern, wurde PknBSAKD mit verschiedenen ATP-Analoga und unterschiedlichen Kristallisationstechniken kristallisiert. Die Struktur wurde mit anderen eukaryotischen und prokaryotischen Serin/Threonin Proteinkinasen verglichen. Ebenso wie das gesamte Protein ist PknBSAKD dazu in der Lage sowohl andere Proteine als auch sich selbst zu phosphorylieren. Im Gegensatz zu der aktiven Form der Kinase in Lösung ist die Kinasedomäne in einer inaktiven Konformation kristallisiert. Das Protein MprF (multiple peptide resistant factor) ist ein Virulenzfaktor von S. aureus. Voraussichtlich besteht es aus einem langen hydrophoben Teil, der 14 Transmembransegmente (TMS) besitzt, und einem hydrophilen C-terminalen Teil. Dieser hydrophile Teil bildet zusammen mit den sechs C-terminalen TMS die Synthase von MprF. Die acht N-terminalen TMS bilden die Flippase. Die Synthase verknüpft Phosphatidylglycerol (PG) mit Lysin zu Lysyl-Phosphatidylglycerol (Lys-PG), das dann von der Flippase in die äußere Schicht der Staphylococcenmembran integriert wird. Dies führt zu einer Änderung der Membranladung und verhindert so die Anlagerung von Defensinen. Die ersten MprF Konstrukte dieser Arbeit bestehen alle aus dem C-terminalen, löslichen Anteil von MprF, wobei das N-terminale Ende dieser Konstrukte variiert. Zusätzlich zu den verschiedenen N-terminalen Enden wurde auch die Anzahl der TMS variiert. Alle Konstrukte konnten kloniert und exprimiert werden. Die Analyse der Proteine ergab allerdings, dass sie aggregiert sind. Das Hauptaugenmerk lag auf dem Verbindungstück zwischen der letzten TMS und dem löslichen Anteil von MprF. Bereits kleine Veränderungen der Anzahl der Aminosäuren in dieser Region beeinflussten das Verhalten des Proteins merklich. Eine Verlängerung des Proteins durch zusätzliche TMS in N-terminale Richtung verringerte die Löslichkeit.