Alternative Splicing Control by Polypyrimidine Tract-Binding Proteins from Arabidopsis thaliana

Abstract

Alternative splicing (AS) is emerging as an important component of gene regulation in plants and has the potential to massively expand the transcriptome, while its functional implications and regulation are not fully understood. The heterogeneous ribonucleoprotein family member polypyrimidine tract-binding protein (PTB) is known to be involved in the regulation of a concerted AS program in differentiating neurons in mammals, however, PTBs in plants were poorly investigated and many questions regarding their regulatory functions in AS remain to be elucidated. Three PTB genes are encoded in the genome of Arabidopsis thaliana, of which two are closely related and one has a comparable homology to human PTB as it has to the two other Arabidopsis PTBs. This work demonstrates that PTBs from Arabidopsis have a gene regulatory potential affecting splicing of their pre-mRNAs in auto- and cross-regulatory circuits as well as having a transcriptome-wide impact on splice site selection. Deep RNA sequencing of AtPTB misexpression lines resulted in the identification of 452 AtPTB-regulated AS events. Interestingly, only AtPTB1 and AtPTB2, representing the two close homologues, were shown to regulate global splicing patterns, whereas AtPTB3 seems not play an important role in this process. In addition, AtPTB-mediated AS is linked to nonsense-mediated decay (NMD) as many target transcripts have NMD eliciting features and the interlocked feedback loops of AtPTB expression includes AS-coupled NMD. Importantly, we established that AtPTB-dependent AS events are coupled to diverse biological processes and upon AtPTB misexpression, changes in phytochrome interacting factor 6 splice patterns coincided with altered rates of abscisic acid-dependent seed germination. Furthermore, we found changes in AS patterns and expression levels of key flowering regulators in an AtPTB1/2 level-dependent manner. In addition to their role in splicing regulation, PTBs are multifunctional proteins involved in various processes of mRNA metabolism and we were able to establish a splicing-independent function of AtPTBs, coinciding with the subcellular localization of AtPTB fluorescent fusion proteins in the cytoplasm, nucleus, and processing bodies. In conclusion, this work shows that AtPTBs regulate their own expression by a negative feedback inhibition and have a global role in AS regulation in Arabidopsis.

Mit der zunehmenden Menge an Transkriptomdaten zeichnet sich alternatives Spleißen (AS) in Pflanzen als wichtiger Schritt der Genexpression ab und hat ein bedeutendes Potenzial die Diversität des Transkriptoms massiv zu erhöhen. Die zu der Familie der heterogenen nukleären Ribonukleoproteinfamilie gehörenden Polypyrimidin Trakt-bindenden Proteine (PTB) regulieren ein genau abgestimmtes alternatives Spleißprogramm im Zuge der Differenzierung von Neuronen in Säugern. Dahingegen wurden die PTBs in Pflanzen bisher kaum erforscht und die zentrale Frage bezüglich ihrer regulatorischen Funktion im AS sind ungeklärt. Im Genom von Arabidopsis thaliana sind drei PTB Homologe (AtPTBs) zu finden, von denen zwei sehr eng miteinander verwandt sind und das dritte PTB Protein eine ähnliche Homologie zu den beiden anderen pflanzlichen PTBs wie zum humanen PTB aufweist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass AtPTBs ihre eigene Expression über AS regulieren wobei eine Transkriptisoform entsteht, die für das Protein kodiert, und eine zweite Isoform, die ein vorzeitiges Stoppkodon beinhaltet. Das vorzeitige Stoppkodon markiert diese Transkripte für den mRNA Abbaumechanismus „Nonsense-mediated mRNA decay“ (NMD) und dadurch konnte bewiesen werden, dass eine Kopplung von AS und NMD in der Regulation der AtPTB Expression stattfindet. Durch die transkriptom weite Analyse von AtPTB-Misexpressionslinien konnte die globale Rolle von AtPTBs im Prozess des AS aufgedeckt und 452 AtPTB-abhängige alternative Spleiß-Ereignisse identifiziert werden. Interessanterweise trifft dies aber nur für die zwei nahe verwandten Proteine AtPTB1 und AtPTB2 zu; AtPTB3 hingegen hat keinen wesentlichen Einfluss auf das AS in Arabidopsis. Zusätzlich konnten wir eine Verknüpfung von AtPTB-reguliertem AS mit dem Prozess der Abscisinsäure-vermittelten Samenkeimung herstellen und zeigen, dass AS und die Expression von zentralen Blühregulatoren AtPTB-abhängig reguliert sind. In Übereinstimmung mit einer Rolle pflanzlicher PTBs in Spleiß-unabhängigen regulatorischen Prozessen steht die subzelluläre Lokalisierung von fluoreszierenden AtPTB-Fusionsproteinen, die im Zellkern, dem Cytoplasma und auch Prozessierungskörperchen (P-Bodies) zu finden sind.