Cohesin-assoziierte Proteine und ihre Funktion bei der Schwesterchromatid-Kohäsion

Abstract

Während des Zellzyklus einer eukaryotischen Zelle werden die Chromosomen in der S-Phase repliziert. Die entstehenden Schwesterchromatiden werden von ihrer Synthese an bis zu ihrer späteren Aufteilung in der Mitose zusammengehalten. Der Zusammenhalt zwischen den Schwesterchromatiden eines jeden Chromosoms wird Schwesterchromatid-Kohäsion genannt. Die Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden wird dabei durch den Proteinkomplex Cohesin ermöglicht. Der Cohesinkomplex besteht aus den drei Kernuntereinheiten Scc1, Smc1 und Smc3 und bildet eine ringförmige Struktur aus, die groß genug ist, um eine oder auch zwei Chromatinfasern topologisch umschließen zu können. Während die Funktion von Scc1, Smc1 und Smc3 als strukturelle Komponenten des Cohesinkomplexes allgemein akzeptiert ist, ist die Rolle der Cohesin-assoziierten Proteine Pds5, Scc3 und Wpl1 weniger gut verstanden. Für die Etablierung der Schwesterchromatid-Kohäsion ist die Acetyltransferase Eco1 notwendig, die zwei benachbarte Lysine des Smc3-Proteins modifiziert. Die Eco1-abhängige Acetylierung der Cohesinkomplexe erfolgt dabei in der S-Phase des Zellzyklus. Eco1 bindet über ein konserviertes PIP-Box-Motiv an den Replikationsfaktor PCNA, die Etablierung der Schwesterchromatid-Kohäsion erfolgt daher wahrscheinlich während oder kurz nach der Replikation der Chromosomen. Zellen ohne funktionelles Eco1-Protein sind nicht lebensfähig, die genaue molekulare Funktion der Acetylierung ist bisher allerdings nur unzureichend aufgeklärt.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pds5, Scc3 und Wpl1 einen ternären Komplex ausbilden, für die stabile Assoziation von Cohesin mit den Chromosomen aber nicht notwendig sind. Die Depletion von Pds5 und Scc3 bzw. die Deletion von WPL1 verursacht allerdings starke Defekte bei der Schwesterchromatid-Kohäsion. Die Kohäsionsdefekte können dabei durch essenzielle Funktionen dieser Proteine bei der Etablierung und/oder Aufrechterhaltung der Kohäsion erklärt werden. Es konnte gezeigt werden, dass nur 8% bzw. 4% der Cohesinkomplexe mit Pds5 bzw. Scc3 für die Lebensfähigkeit der Zelle ausreichen. Daher ist es unwahrscheinlich, dass Pds5 und Scc3 als stabile Komponenten des Cohesinkomplexes für die Aufrechterhaltung der Schwesterchromatid-Kohäsion verantwortlich sind. Ich bevorzuge das Modell, dass sowohl Pds5 wie auch Scc3 während der Etablierung der Schwesterchromatid-Kohäsion notwendig sind, für die Aufrechterhaltung der Kohäsion in späteren Zellzyklusphasen aber nicht mehr benötigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Interaktion zwischen Eco1 und PCNA genauer untersucht. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse konnte die Bindung von Eco1 an PCNA auf molekularer Ebene visualisiert werden. Es zeigte sich, dass die auf dem konservierten PIP-Box-Motiv basierende Interaktion zwischen Eco1 und PCNA strukturell nahezu identisch mit anderen PIPBox/PCNA-Komplexen ist, obwohl im PIP-Box-Motiv des Eco1-Proteins typische N- und C-terminal flankierende Sequenzen nicht vorhanden sind.

In an eucaryotic cell cycle DNA is replicated during S phase, generating two sister chromatids for each chromosome. The sister chromatids are hold together from their synthesis onwards until their separation in mitosis. The cohesion between sisters is called sister chromatid cohesion. Sister chromatid cohesion is achieved by a protein complex called cohesin. The ring-shaped cohesin complex consists of the three subunits Scc1, Smc1 and Smc3. The cohesin ring is big enough to entrap one or two chromatin fibers inside the protein ring. Whereas the core subunits Scc1, Smc1 and Smc3 are structural elements of cohesin, the role of the associated proteins Pds5, Scc3 and Wpl1 is less clear. The acetyltransferase Eco1 is required for the establishment of sister chromatid cohesion. The essential targets of Eco1 are two adjacent lysine residues of Smc3, which are both acetylated during S phase. Eco1 interacts with PCNA via a conserved PIP-box motif, therefore the establishment of sister chromatid cohesion seems to be linked to DNA replication. Cells without functional Eco1 protein are not viable, but the molecular function of cohesin acetylation is still not understood.

In this work, I did show that Pds5, Scc3 and Wpl1 form a ternary complex in vitro but are not required for the stable association of cohesin with chromosomes in vivo. The depletion of Pds5 and Scc3 or the deletion of WPL1 results in severe sister chromatid cohesion defects. The cohesion defects could be caused by errors during establishment and/or maintenance of sister chromatid cohesion. I did show that 8% cohesin with Pds5 and 4% cohesin with Scc3 is sufficient for cell viability, which is inconsistent with a role of this proteins during maintenance of sister chromatid cohesion. I suggest that Pds5 and Scc3 are essential factors during establishment of sister chromatid cohesion but become dispensable after S phase. In addition, I investigated the interaction between Eco1 and PCNA. I solved the X-ray structure of the Eco1 PIP-Box motif bound to PCNA and showed that this interaction is highly conserved on a structural level, although typical N- and C-terminal parts of the PIP-Box motif are not present in Eco1.