Discovering new targets for glucocorticoids

Abstract

Glucocorticoids are widely used in the treatment of rheumatic diseases, but the exact molecular targets especially for fast occurring effects are not yet understood. The identification of direct nongenomic drug-protein interaction partners was the objective of this thesis. For the used target-fishing approach it was necessary to immobilize the glucocorticoids onto a matrix. The required chemical modifications were tested for its biological activity. GC-3-CMO derivatives were the most active compounds and applied for further experiments. Using the target-fishing approach with GC-3-CMO immobilized beads a high number of possible target candidates were observed. A refinement of the elution techniques led to the elution of fewer nonspecific proteins. In addition, a membrane isolation in combination with the target-fishing approach resulted in the identification of proteins such as the adenosine nucleotide transporter. The excision of bands from a SDS-PAGE is biased and can only detect high abundant proteins. To overcome this biased approach, stable isotope labeling of amino acids in cell culture (SILAC) was applied. SILAC metabolically labels the whole proteome of proliferating cells with heavy, medium or light amino acid isotopes. The chemical proteomics approach is applied for the different labeled cell lysates leading to three distinct experiments that will be mixed in the end and quantified. SILAC was performed for glucocorticoids and sex hormones to compare possible target candidates and eliminate unspecific interaction partners. The approach was able to identify 648 proteins for glucocorticoids and 480 proteins for sex hormones. After applying several evaluation techniques 33 target proteins for dexamethasone, 14 target proteins for progesterone and 27 target proteins for testosterone remained. Among the identified interaction partners for dexamethasone were several multimeric glucocorticoid receptor complex-containing proteins like heat shock proteins (Hsp90, Hsp70, Hsp40). Another protein that was identified in two previous target-fishing experiments, peroxiredoxin 1, was detected. An additional SILAC with an excess of soluble dexamethasone (=soluble competition) that competes with dexamethasone-immobilized beads was performed resulting in the identification of several tropomyosins. Peroxiredoxin 1 (Prdx1) as possible direct interaction partner for dexamethasone was investigated in more detail. A direct binding of recombinant Prdx1 to glucocorticoid-immobilized beads was confirmed. This interaction does not occur, when an excess of soluble dexamethasone competes with the dexamethasone-immobilized beads indicating a direct Prdx1-GC complex formation. The influence of dexamethasone (Avram et al.) and Prdx1 (Neumann et al.) on Akt phosphorylation has already been described. Prdx1 protects phosphatase and tensin homolog (PTEN) from oxidation under normal cellular conditions regulating PI3K signaling leading to a decrease in Akt phosphorylation. The same relation was observed for dexamethasone. The exact molecular target for this dexamethasone-induced down-regulation of Akt phosphorylation is unknown. The experimental design used in this thesis for the detection of a possible interaction between dexamethasone and Prdx1 could not show any difference between glucocorticoid and vehicle treatment on Akt phosphorylation. Prdx1 exhibits a dual function as a peroxidase under normal cellular conditions and as an oligomeric molecular chaperone during oxidative stress. The impacts of glucocorticoids on these two functions were characterized. A Prdx1 activity assay with recombinantly purified proteins was performed, which showed that dexamethasone does not influence Prdx1 peroxidase activity. The effect of dexamethasone on the chaperone function of Prdx1 was tested with an oligomerization assay. It could be shown that dexamethasone increases the formation of monomers and trimers and is likely to decrease dimers and tetramers. All these results indicate Prdx1 as a drug target for dexamethasone, however the exact molecular interaction and its implication on GC-induced cellular function remains to be further elucidated.

Glukokortikoide werden häufig in der Behandlung der rheumatoiden Arthritis verwendet. Die molekularen Angriffspunkte der Glukokortikoide insbesondere für schnell einsetzende Effekte, die innerhalb von Sekunden bis Minuten eintreten, sind allerdings noch nicht bekannt. Die Identifizierung von direkten nicht genomischen Glukokortikoid-Interaktionspartnern war das Ziel dieser Dissertation. Die verwendete Technik war das Target-Fishing. Hierfür müssen Glukokortikoide an eine Matrix immobilisiert werden. Die nötige chemische Modifikation kann die biologische Aktivität der Glukokortikoide beeinflussen. Aus diesem Grund wurden die Glukokortikod-Derivate auf ihre biologische Aktivität getestet. Glukokortikoide, die an Position 3 eine Modifikation trugen, waren die biologisch aktivsten Derivate und aus diesem Grund wurden sie für weitere Experimente verwendet. Das Target-Fishing dieser führte zu einer Vielzahl an möglichen Zielproteinen. Deshalb wurden die Elutionstechniken angepasst, so dass weniger nicht spezifische Proteine eluiert wurden. Eine Membranisolierung reicherte spezifisch Membranproteine an und konnte zur Identifizierung des adenosine nukleotide translocators (ANT) verwendet werden. Das Ausschneiden von Banden aus einer SDS-PAGE geschieht nach Augenmaß und ist auf häufig vorkommende Proteine beschränkt. Um diese Einschränkung zu umgehen, wurde das stable isotope labeling of amino acids in cell culture (SILAC) durchgeführt. SILAC markiert metabolisch das gesamte Proteom proliferierender Zellen mit schweren, mittleren oder leichten Aminosäurenisotopen. Das Target-Fishing wurde für die unterschiedlich markierten Zelllysate angewendet. Dies führte zu drei unterschiedlichen Experimenten, die am Ende gemischt und quantifiziert wurden. SILAC wurde für Glukokortikoide und Sexualhormone verwendet damit mögliche Zielproteine verglichen und unspezifische Interaktionspartner eliminiert werden konnten. Es wurden für Glukokortikoide 648 Proteine und für Sexualhormone 480 Proteine identifiziert. Nach Anwendung diverser Evaluierungstechniken blieben 33 mögliche Interaktionspartner für Dexamethason, 14 für Progesteron und 27 für Testosteron übrig. Unter den identifizierten Interaktionspartnern waren verschiedene Proteine wie Heat shock Proteine, die mit dem Glukokortikoid Rezeptor Komplex assoziiert sind. Ein anderes Protein, das in zwei vorherigen Target-Fishing Experimenten identifiziert wurde, Peroxiredoxin 1, konnte erneut detektiert werden. Ein zusätzliches SILAC Experiment bei dem ein Überschuss an Dexamethason mit dem an der Matrix immobilisierten Dexamethason konkurriert wurde durchgeführt und verschiedene Tropomyosine konnten ermittelt werden. Peroxiredoxin 1 (Prdx1) als möglicher Interaktionspartner für Dexamethason wurde genauer untersucht. Eine direkte Bindung von rekombinanten Prdx1 an Glukokortikoid-immobilisierten Matrices konnte gezeigt werden. Diese Interaktion findet nicht statt, wenn ein Überschuss an Dexamethason mit dem an der Matrix immobilisierten Dexamethason konkurriert. Dies lässt auf eine direkte Interaktion zwischen Dexamethason und Prdx1 schließen. Der Einfluss von Dexamethason (Avram et al.) und Prdx1 (Neumann et al.) auf die Akt Phosphorylierung wurde bereits beschrieben. Prdx1 schützt PTEN (phosphatase and tensin homolog) unter normalen zellulären Konditionen vor oxidativem Stress, das zu einer Abnahme der Akt Phosphorylierung führt. Eine Senkung der Akt Phosphorylierung wurde auch für Dexamethason beschrieben, allerdings ist das molekulare Ziel dieser Wirkung unbekannt. Der hier verwendete experimentelle Aufbau zur Untersuchung eines möglichen Zusammenhangs zwischen Dexamethason und Prdx1 konnte keinen Unterschied zwischen Dexamethason und Kontrollbehandlung in der Akt Phosphorylierung feststellen. Prdx1 besitzt eine duale Funktion. Unter normalen zellulären Stoffwechseleigenschaften wirkt Prdx1 als eine Peroxidase, während oxidativen Stresses wirkt Prdx1 als ein oligomeres Chaperon. Der Einfluss von Dexamethason auf diese beiden Funktionen wurde untersucht. Eine Prdx1 Aktivitätstest mit rekombinant gereinigten Proteinen wurde durchgeführt. Dieser zeigte, dass Dexamethason keinen Einfluss auf die Peroxidasen Aktivität von Prdx1 ausübt. Der Effekt von Dexamethason auf die Chaperon Funktion wurde mit einem Oligomerisationstest geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass Dexamethason die Formierung von Monomeren und Trimeren erhöht und es scheint, dass Dexamethason die Bildung von Dimeren und Tetrameren senkt. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass Prdx1 ein möglicher Interaktionspartner für Dexamethason ist. Allerdings ist die exakte molekulare Wirkweise noch ungeklärt und muss weiterhin untersucht werden.