Ergosterol Content specifies Targeting of Tail-Anchored Proteins to the Mitochondrial Outer Membrane

Abstract

The mitochondrial outer membrane harbors proteins of different topologies. Among them are the tail-anchored proteins that are characterized by a single transmembrane domain very close to the C-terminus. The N-terminal part is protruding into the cytosol. The targeting information is enclosed in the transmembrane domain and its flanking regions. Therefore tail-anchored proteins have to be inserted into their target membranes in a posttranslational manner. Previous reports suggest that mitochondrial tail-anchor proteins do not utilize any known import components for their membrane integration. This work addressed several questions concerning the biogenesis of mitochondrial tail-anchored proteins in Saccharomyces cerevisiae. The results show that upon deletion of the ER-resident P-type ATPase Spf1 the mitochondrial tail-anchored protein Fis1 and the signal-anchored protein OM45 are partially mis-localized to ER membranes. It was shown that this mis-localization is due to altered ergosterol contents in the mitochondrial and ER membranes. Moreover a site-directed in vivo cross-linking approach revealed an interaction between the transmembrane domain of Fis1 and Ssa1/2. It could be further shown that Ssa proteins play a role in the biogenesis of Fis1. Pex19, the major import receptor for peroxisomal membrane proteins was identified as a stabilizing factor for Fis1. Based on the results of this study and previous reports a model for the biogenesis of mitochondrial tail-anchored protein Fis1 can be proposed. Fis1 is synthesized on cytosolic ribosomes and subsequently associates with cytosolic chaperones. Ssa proteins bind to the transmembrane region of Fis1 and guide it to the mitochondria. The targeting factor for peroxisomal localized Fis1 might probably be Pex19. The final integration into the target membrane occurs in both cases in an unassisted manner and is facilitated by the low ergosterol content of the membranes. Taken together, the biogenesis of mitochondrial tail-anchored protein relies on cytosolic chaperones and a distinct lipid composition of the target membrane.

Die äußere mitochondriale Membran enthält Proteine verschiedener Topologie. Unter diesen finden sich die c-terminal verankerten Proteine, die durch eine einzelne Transmembrandomäne nahe dem C-Terminus des Proteins charakterisiert sind. Der größere n-terminale Abschnitt des Proteins ragt ins Cytosol der Zelle. Die mitochondriale Erkennungssequenz ist in der Transmembrandomäne und ihren flankierenden Regionen kodiert. Deshalb müssen c-terminal verankerte Proteine auf posttranslationalem Weg in ihre Zielmembran integriert werden. Vorherige Forschungen deuten darauf hin, dass mitochondriale c-terminal verankerte Proteine für ihre Membran-Insertion keine der bekannten mitochondrialen Import-Maschinerien benutzen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Fragen der Biogenese von mitochondrialen c-terminal verankerten Proteinen in Saccharomyces cerevisiae. Die Ergebnisse zeigen, dass das mitochondriale c-terminal verankerte Protein Fis1 und das mitochondriale n-terminal verankerte Protein OM45 durch die Deletion der ER-ansässigen P-Typ ATPase Spf1 eine partielle Misslokalisation in ER-Membranen aufweisen. Es wurde gezeigt, dass diese Misslokalisation durch einen veränderten Ergosterolgehalt der mitochondrialen Membranen sowie der ER-Membranen verursacht wird. Außerdem konnte durch ein positionsspezifisches in vivo Protein-Verknüpfungs-Experiment eine Interaktion zwischen der Transmembrandomäne von Fis1 und den Chaperonen Ssa1 und Ssa2 nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte Pex19, der dominante Import-Rezeptor für peroxisomale Membranproteine, als stabilisierender cytosolischer Faktor für Fis1 identifiziert werden. Basierend auf den Resultaten dieser Arbeit und früheren Forschungsergebnissen wird für die Biogenese von Fis1 daher das folgende Modell vorgeschlagen: Fis1 wird von cytosolischen Ribosomen synthetisiert und assoziiert sich im Folgenden mit cytosolischen Chaperonen. Ssa-Proteine binden an die Transmembrandomäne von Fis1 und führen das Protein zu den Mitochondrien. Peroxisomal lokalisiertes Fis1 interagiert möglicherweise im Cytosol mit Pex19. Der finale Schritt der Membran-Integration findet ohne die Hilfe von assistierenden Faktoren statt und wird vielmehr durch den geringen Ergosterolgehalt der Zielmembran ermöglicht. Daher basiert die Biogenese von mitochondrialen c-terminal verankerten Proteinen auf der Interaktion mit cytosolischen Chaperonen und der spezifischen Lipid-Komposition der Zielmembran.