Chemical proteomics strategies for elucidation of cellular steroid hormone targets

Abstract

The aim of the given work was the development and improvement of affinity chromatography-based methodologies as a means to elucidate the cellular target structures of endogenous and synthetic steroid hormones. Steroid hormones are among the most important regulators of physiological processes in mammals. Moreover, pharmacological agents based on or derived from steroid hormones are indispensable for the treatment of diseases related inflammation, the immune defense and the deregulation of the hormone balance. Frequently, side effects of varying severity are encountered in patients treated with hormonally active agents due to interference with the endogenous hormone balance. The nuclear receptor-mediated mechanism of action of steroid hormones leading to regulation of gene transcription and expression is relatively well understood. On the contrary, knowledge of steroid hormone effects mediated by other cellular target structures lacks far behind. Partially this is due to the lack of knowledge about the identity of these target structures. In the recent past, considerable scientific effort was directed toward the elucidation of the target structures of many pharmacological agents as well as endogenous small molecules. Frequently employed for this purpose are methodologies based on the affinity of the agent under investigation to its endogenous target, mostly proteins, which allows the specific isolation of these structures. The analysis and identification of the isolated targets is achieved by gel-electrophoresis, classical protein sequencing, antibody reactions and increasingly by mass spectrometry. As of yet, no systematic chemoproteomics study regarding the elucidation of cellular steroid hormones has been published. For this reason, a project was launched aiming for the establishment of the drug interactome of steroid hormones by means of affinity chromatography-based methodologies combined with state-of-the-art mass spectrometry analyzes. To provide small molecular probes allowing for protein enrichment, a series of steroid conjugates for immobilization derived from the sex hormone testosterone and progesterone and the glucocorticoids hydrocortisone and dexamethasone were prepared. Attachment of a carboxylic acid function to the steroid scaffold was achieved either by oxime ligation of the steroid ketones with O-(carboxymethyl)oxyamine or by addition of a pentanoic acid residue to the steroid 7alpha-position, respectively. In the initial experiments, the thus obtained steroidal carboxylic acids were immobilized on Sepharose® or TOYOPEARL® and the produced affinity matrices used for protein enrichment from various cell lysates. To decrease the amount of non-specifically fished proteins the aforementioned steroidal carboxylic acids were further conjugated to tetra ethylene glycol spacers. These derivatives were then used for the affinity enrichment of protein from natural proteomes as well as from stable isotope-labeled (SILAC) proteomes. An attempt to further increase protein sample quality in regard to complexity and specificity led to the synthesis of an additional series of photoreactive steroid conjugates. These probes ought to facilitate the covalent labeling of target structures under physiological conditions in homogenous phase. The selective enrichment of the photo-labeled protein targets should be achieved via the bioorthogonal azide conjugation handle found on the given steroid probes. Thus, the azide moiety was targeted chemoselectively by application of a strain promoted Huisgen-cycloaddition reaction utilizing cyclooctyne conjugates. The covalently immobilized proteins can be separated from the non-covalently bound background proteins by simple washing. Recovery of the specifically bound proteins can be achieved by cleavage of a photo sensitive o-nitrobenzyl linker incorporated into the cyclooctyne conjugates by irradiation with UV light >350 nm.

Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Verbesserung Affinitäts-Chromatographie basierter Methoden für die Bestimmung der zellulären Zielstrukturen endogener und synthetischer Steroidhormone. Steroidhormone sind mit die wichtigsten Regulatoren physiologischer Prozesse in Säugetieren. Darüber hinaus sind Wirkstoffe basierend auf Steroidhormonen für die Behandlung verschiedener Krankheiten, welche im Zusammenhang mit der Deregulierung des Hormonhaushaltes, der Immunabwehr oder entzündlicher Prozesse stehen, unersetzlich. Bei der Behandlung mit Wirkstoffen welche hormonelle Aktivität aufweisen kommt es häufig zu Nebenwirkungen unterschiedlicher Schweregrade da diese Wirkstoffe in das physiologische Hormongleichgewicht des Patienten eingreifen. Obgleich die Wirkmechanismen der Steroidhormone betreffend der Regulation von Gen Transkription und Expression vermittelt durch den jeweiligen spezifischen nuklearen Rezeptor sehr genau untersucht und verstanden wurden, sind die Effekte herbeigeführt durch Wechselwirkung mit anderen zelluläre Zielstrukturen bisher nur unzureichend aufgeklärt. Einer der hauptsächlichen Gründe hierfür ist die Nicht-Kenntnis über die Identität dieser Zielstrukturen. In der jüngeren Vergangenheit wurde ein erheblicher wissenschaftlicher Aufwand betrieben die Zielstrukturen verschiedener pharmazeutischer Wirkstoffe als auch kleiner endogener Moleküle aufzufinden. Häufig angewandt werden hierbei Reinigungsmethoden basierend auf der Affinität des untersuchten Agens zu seinem natürlichen Substrat, welche die Isolierung der betreffenden Zielstrukturen, meist Proteine, ermöglicht. Die Untersuchung und Identifizierung der erhaltenen Proteine geschieht hierbei durch Gel-Elektrophorese, Antikörper Reaktionen und in zunehmenden Maße durch massenspektrometrische Verfahren. Da für endogene als auch synthetische Steroidhormone bisher noch keine systematische Studie betreffend der Aufklärung ihrer zellulären Zielstrukturen berichtet wurde, hat man sich an dieser Stelle zum Ziel gesetzt mittels Affinitäts-basierter Reinigungsmethoden und der Anwendung moderner massenspektrometrischen Messtechniken den Grundriss des „Drug-Interactome“ der Steroidhormone zu zeichnen. Zu eben diesem Zweck wurde eine Serie von Steroidderivaten abgeleitet von den Geschlechtshormonen Testosteron und Progesteron sowie den Glucocorticoiden Hydrokortison und Dexamethason synthetisiert, welche sich für die Anbindung an Amino-funktionalisierte polymere Harze mittels standardisierter Peptid-chemischer Methoden eignen. Einführung einer Carboxyl-Funktion in das Steroidgerüst der Stammverbindungen wurde hierbei durch Oxim-Bildung mit O-(Carboxymethyl)oxyamin an den Positionen 3 und 21, durch oxidativen Abbau der C17 Seitenkette zum entsprechenden 17-Carboxylat oder durch anknüpfen eines Pentansäure-Restes an Position 7alpha des Steroidgerüstes bewerkstelligt. In den ersten Experimenten wurden die so erhaltenen Steroid-Karbonsäuren auf Amino-funktionalisierter Sepharose® oder TOYOPEARL® immobilisiert und die Affinitätsmatrizes zur Reinigung verschiedener Zell-Lysate eingesetzt. Um in vorangeschrittenen Versuchen die Menge an unspezifisch gebundenen Proteinen zu reduzieren, wurde eine weitere Serie von Steroidderivaten hergestellt, welche vor der Immobilisierung mit einen entsprechenden Amino-/Carboxyl-funktionalisierten Tetraethylenglykol-Linker konjugiert wurden. Die erhaltenen Derivate wurden dann für die Affinitäts-Reinigung natürlicher als auch Isotopenmarkierter (SILAC) Zell-Lysate eingesetzt. Um die Probenqualität in Hinblick auf Verteilung und Spezifität der isolierten Proteine weiter zu verbessern, wurde zusätzlich eine Reihe von Foto-reaktiven Steroidderivaten hergestellt. Diese Derivate sollten zur kovalenten Konjugation der Zielstrukturen unter physiologischen Bedingungen in homogener Phase dienen. Die selektive Anreicherung der kovalent Verknüpften Biomoleküle sollte dabei über einen Azid-Rest an den reaktiven Steroid-Derivaten ermöglicht werden. Dieser kann chemoselektiv in einer spannungsvermittelten Huisgen 1,3-Cycloadditions Reaktion zwischen dem Cyclooktin-Derivat und dem Azid in ein stabiles Triazol überführt und auf diese Weise auf einem entsprechend derivatisierten polymeren Harz eingefangen werden. Die Abtrennung nicht kovalent gebundener Proteine ist dabei leicht zu bewerkstelligen. Um die eingefangenen Proteine wieder von der polymeren Matrix abzuspalten wurde ein Foto-sensitiver Linker auf o-Nitrobenzyl-Basis verwendet.