Generation and Characterization of Transgenic Mice for Noninvasive Cell Tracking with PET and for FRET-based cGMP Imaging

Abstract

Moderne Bildgebungsmethoden werden im Rahmen der Grundlagenforschung und der angewandten biomedizinischen Forschung immer häufiger in Studien mit genetisch modifizierten Mäusen eingesetzt. Die nichtinvasive Bildgebung in transgenen Mäusen ermöglicht Studien, die mit konventionellen Methoden bisher nicht möglich waren. Diese Studien können dazu beitragen, qualitativ hochwertige Daten bei verringerten Tierzahlen zu erhalten. Insbesondere ermöglicht die nichtinvasive Bildgebung auch Einblicke in komplexe biologische Prozesse, die nur im lebenden Tier untersucht werden können. Das Ziel dieser Arbeit war es, transgene Mauslinien herzustellen und zu charakterisieren, die für die nicht-invasive Verfolgung von Zellen („Cell tracking“) mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder die Visualisierung des intrazellulären Signalmoleküls cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) durch optische Biosensoren verwendet werden können.

Das nicht invasive „Cell tracking“ mittels PET kann dazu genutzt werden, Zellproliferation, -migration, oder -tod im Rahmen verschiedener physiologischer oder pathologischer Prozesse zu visualisieren. Zur genetischen Markierung ausgewählter Zellpopulationen wurde eine Mauslinie hergestellt, die ein konditionales HSV1-sr39tk PET-Reportertransgen im ubiquitär exprimierten ROSA26 Lokus trägt. HSV1-sr39tk stellt eine modifizierte Variante der Thymidinkinase aus dem Herpes simplex-Virus dar, die PET-Tracer wie z.B. 4 [18F]-Fluoro-3-(hydroxymethyl)butyl]guanin ([18F]FHBG) phosphorylieren kann. Die Anreicherung von phosphorylierten Tracer-Molekülen in HSV1-sr39tk-exprimierenden Zellen kann dann mittels PET nachgewiesen werden. In der neu hergestellten Mauslinie kann die Expression von HSV1 sr39tk mit Hilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems zelltypspezifisch aktiviert werden, sodass verschiedene Zelltypen durch Verpaarung mit geeigneten Cre-Mauslinien markiert werden können. Die Expression von HSV1-sr39tk und die Aufnahme von [18F]FHBG in Abhängigkeit von Cre-Rekombination wurde in embryonalen Stammzellen gezeigt. Für PET-Studien wurden Mäuse hergestellt, die HSV1-sr39tk in den Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse herstellen. In einem ersten PET-Experiment konnte gezeigt werden, dass sich [18F]FHBG tatsächlich in Beta-Zellen anreichert. Es sind nun weitere Studien notwendig, um die in vivo-Sensitivität und -Reproduzierbarkeit der neu hergestellten HSV1-sr39tk-Mauslinie zu testen.

Der sekundäre Botenstoff cGMP beeinflusst zahlreiche Körperfunktionen wie Glattmuskeltonus, Thrombozyten-Aggregation und neuronale Plastizität, wobei die zugrundeliegenden molekularen Wirkmechanismen oft nicht vollständig aufgeklärt sind. cGMP-spezifische Biosensoren, wie die auf Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) basierenden cGMP-Indikatoren (cGis), sind wichtige Werkzeuge zur Untersuchung des cGMP-Signalwegs. Um deren Nutzung im lebenden Tier zu ermöglichen, wurden transgene, cGi-exprimierende Mauslinien hergestellt. Zunächst wurden aus diesen Mäusen neuronale Zellen und Glattmuskelzellen der Aorta, Blase und des Darms gewonnen, kultiviert und mittels FRET-Mikroskopie untersucht. Die Stimulation mit Stickstoffmonoxid (NO) führte in Körnerzellen des Kleinhirns und in allen Glattmuskelzelltypen zur cGMP-Bildung durch die lösliche Guanylatcyclase. Andererseits lösten natriuretische Peptide, die membranständige Guanylatcyclasen aktivieren, in Glattmuskelzellen verschiedener Herkunft unterschiedliche Reaktionen aus. Eine veränderte Reaktivität wurde darüber hinaus in Gegenwart von Phosphodiesterase-Inhibitoren beobachtet, die darauf hinweist, dass in kultivierten Glattmuskelzellen mindestens zwei verschiedene Phosphodiesterase-Familien für den Abbau von cGMP verantwortlich sind. Darüber hinaus konnte eine NO-induzierte cGMP-Synthese auch in den Gefäßen der Netzhaut beobachtet werden, die zuvor aus cGi-exprimierenden Mäusen isoliert wurde. Um zu zeigen, dass der cGi-Sensor auch für Experimente in lebenden Tieren genutzt werden kann, wurden Intravitalmikroskopie-Studien mit cGi-exprimierenden Tieren durchgeführt. Hierbei konnten NO-induzierte cGMP-Transienten in den Gefäßwänden des Cremaster-Muskels am anästhesierten Tier verfolgt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die neu hergestellten Mauslinien wertvolle Quellen für cGi-exprimierende Primärzellen darstellen und vor allem dass sie für Studien am lebenden Tier genutzt werden können.

Abschließend lässt sich sagen, dass die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten und charakterisierten Mauslinien der Untersuchung verschiedener Tiermodelle unter in vivo-Bedingungen dienen können, z.B. der Untersuchung von neurodegenerativen oder kardiovaskulären Erkrankungen sowie von Diabetes und Krebs.

In recent years, modern imaging techniques are being developed for highly sophisticated studies with genetically modified model organisms. Mice are the most commonly used mammalian model organisms in basic and applied biomedical research. Noninvasive imaging of transgenic mice allows for previously unfeasible experimental designs that can improve data quality with fewer animals needed in a particular study. In addition, and most importantly, novel imaging strategies provide new insights into biological processes that can only be studied in living animals. The aim of this work was to generate and characterize transgenic mice for 1) noninvasive cell tracking with positron emission tomography (PET) and 2) visualization of the intracellular signaling molecule cyclic guanosine monophosphate (cGMP) with biosensors based on fluorescence resonance energy transfer (FRET).

PET-based cell tracking can be used to follow cell proliferation, migration, or death associated with physiological or pathological processes. To label defined cell populations genetically for PET imaging, mice were generated carrying a conditional HSV1-sr39tk PET reporter transgene in the ubiquitously expressed ROSA26 locus. HSV1-sr39tk is an engineered variant of the Herpes simplex virus thymidine kinase, which phosphorylates PET tracers like 4-[18F]-Fluoro-3-(hydroxymethyl)butyl]guanine ([18F]FHBG) leading to their accumulation in HSV1-sr39tk-expressing cells. In the newly generated mouse line, Cre/loxP-mediated recombination activates HSV1-sr39tk expression driven by the CMV-enhancer/beta-actin/beta-globin (CAG) promoter. Thus, various tissues can be labeled by cross-breeding the conditional HSV1-sr39tk line to different tissue-specific Cre transgenic mouse lines. HSV1-sr39tk expression and [18F]FHBG accumulation were detected in a Cre-dependent manner in embryonic stem cells carrying the conditional HSV1-sr39tk transgene. For PET experiments, mice were generated expressing HSV1-sr39tk in pancreatic beta cells. Indeed, in a preliminary in vivo PET experiment it was shown that [18F]FHBG accumulates in beta cells. Further work is necessary to characterize the conditional HSV1-sr39tk mouse line for its sensitivity and reproducibility in vivo.

The second messenger cGMP modulates diverse physiological processes including smooth muscle relaxation, platelet aggregation, and neuronal plasticity, but the underlying molecular mechanisms are often poorly understood. Sensor proteins that detect cGMP, such as FRET-based ‘cGMP indicators’ (cGis), are valuable tools for the analysis of cGMP signaling. To enable studies with cGMP biosensors in living mice, cGi-transgenic animals were generated. Neural cells as well as smooth muscle cells (SMCs) from aorta, bladder, and colon were isolated from cGi-expressing mice and used for FRET imaging experiments. cGMP synthesis via nitric oxide (NO)-stimulated soluble guanylyl cyclase was observed in cerebellar granule neurons and all SMC types. Interestingly, different SMC types showed different abilities to elevate cGMP in response to natriuretic peptides, which stimulate membrane-associated particulate guanylyl cyclases. Altered cGMP responses in the presence of phosphodiesterase inhibitors indicated that at least two phosphodiesterase families contribute to cGMP degradation in cultured SMCs. Furthermore, NO-induced cGMP elevations were observed in the vasculature of retinas isolated from cGi-expressing animals. Importantly, the feasibility of cGi-based imaging in living animals could be shown in intravital microscopy studies. NO treatment led to transient cGMP elevations in arterial walls of the cremaster muscle of anesthetized cGi-transgenic mice. Thus, the newly generated cGMP sensor mouse lines do not only represent valuable sources for cGi-expressing primary cells, but they can be used for intravital imaging studies in living animals.

In summary, the mouse lines that were generated and characterized in this work will find widespread applications, and in combination with other genetic mouse models, they will help to gain further insights into physiological or disease-associated processes like cardiovascular and neurodegenerative diseases, cancer and diabetes under in vivo conditions.