On Teleost Muscle Stem Cells and the Vertical Myoseptum as Their Niche

Abstract

Pax7+ muscle stem cells (MSCs) drive muscle growth and repair in tetrapod muscle. A zebrafish pax7::GFP line was generated to study teleost MSCs by intravital imaging. This non-invasive, explorative and unbiased approach (A) allows muscle stem cells and their committed progeny to be monitored in their unperturbed tissue microenvironment, and (B) allows clonal relationships amongst Pax7+ myogenic progenitors to be clarified by intravital imaging-based clonal analysis. In this way it was possible to reconstruct the myogenic lineage both qualitatively and quantitatively. This tool was further used to isolate teleosts MSCs and perform transcriptional profiling. The data presented here show (A) that teleost MSCs derive directly from a population of Pax7+ dermomyogenic progenitors, which form an epithelial sheet of cells - the teleost dermomyotome - covering the maturing somite, (B) that the niche for teleost MSCs is the vertical myoseptum, a thin sheet of extracellular matrix connecting neighbouring somites, and (C) that teleost MSCs contribute to the formation of their own niche by secreting a number of ECM components.

The use of zebrafish as a model system further allowed a systematic reverse genetics screen involving more than 20 genes equaling roughly 12,5% of the profiling candidate genes to be performed, using morpholinos, which provide a rapid and inexpensive way of assessing gene function. This led to the identification of muscle-related phenotypes for csf1b, wfdc1, wif1, which encode secreted signaling molecules and modulators, for cdon, A2CEY7, which are present on the cell surface, as well as for fmod, thbs4b, tnw, olfml2Bb, which are extracellular matrix components. While some of these knockdowns affect the myogenic lineage primarily at the level of the muscle stem cells, others seem to impact on myoblast function or perturb the attachment of muscle fibres to the extracellular matrix. The AVEXIS technology was exploited to screen a library of extracellular bait proteins for interaction with MSC-derived secreted proteins, including cell surface molecules, ligands and ECM components. The combination of functional and biochemical data has led to a number of distinct projects, whose core observations and conclusions are briefly summarized in the following:

• Tenascin W (Tnw) - an MSC-derived hexameric ECM component, which is abundantly expressed in human glioblastoma as well as tumors of the brain, breast and colon - interacts with the Notch ligands DeltaA and B. Upon knockdown of Tnw MSC number declines dramatically as a result of illegitimate activation. These findings establish Tnw, one of the most specific markers of human cancer, as an MSC-derived niche molecule, and implicate Tnw in Notch signaling.

• Csf1b is one of most strongly upregulated genes in teleost MSCs. csf1a and csf1b as well as the csf1r receptor paralogs diverged in terms of function and expression pattern during the course of teleost evolution. pax7 reporter activity is strongly reduced in csf1ra mutant (pfeffer) xanthophores suggesting that Csf signaling regulates Pax7 expression in the neural crest and possibly also the myogenic lineage.

• The GPI-anchored cell surface molecule A2CEY7 is a bona fide novel, essential component of Hh signaling.

• Seraf, an EGF-type orphan ligand expressed in the dermomyotome and later by MSCs, binds to FGFR4 receptor constituting an autocrine feedback-loop. Apart from its interaction with FGFR4 two further novel interactions with the extracellular hub protein Opticin and Kon-Tiki 3/Cspg4 were detected.

Pax7+ Muskelstammzellen (MSCs) erlauben das Wachstum und die Regeneration der Muskulatur der Tetrapoda. Im Zuge der vorliegenden Studie ist eine pax7::GFP transgene Zebrafischlinie erzeugt worden, die es erlaubt MSCs durch intravitale Mikroskopie zu untersuchen. Dieser nicht-invasive, explorative und vorurteilsfreie Ansatz erlaubt es (A) MSCs und ihre Progenitoren im ungestörten Gewebskontext zu verfolgen und (B) die klonalen Beziehungen zwischen Pax7+ myogenen Progenitoren durch intravitale klonale Analyse aufzuklären. In dieser Weise war es möglich die myogene Linie qualitativ und quantitativ zu rekonstruieren. Die pax7::GFP transgene Linie wurde weiterhin benutzt, um MSCs zu isolieren und im Hinblick auf ihre Genexpression zu analysieren. Die hier präsentierten Daten zeigen (A) daß die MSCs der Knochenfische direkt aus einer Population Pax7+ dermomyogener Progenitoren hervorgehen, die ein epitheliales Zellblatt – das Dermomyotom der Knochenfische – bilden, welches den reifenden Somiten überspannt, (B) daß das vertikale Myoseptum, eine dünne Schicht extrazellulärer Matrix zwischen den Somiten, die Nische für MSCs in Knochenfischen bildet, und (C) daß die MSCs der Knochenfische selbst zum Aufbau ihrer Nische beitragen.

Die Verwendung des Zebrafischs als Modellsystem erlaubte es im Weiteren eine systematische revers-genetische Suche durchzuführen, in die mehr als 20 Gene eingeschloßen wurden, die in etwa 12,5% der Kandidatengene des Transkriptionsprofils entsprechen. Zu diesem Zweck wurden Morpholinos verwendet, die es erlauben schnell und kostengünstig Rückschlüsse auf die Funktionen der jeweiligen Kandidatengene zu ziehen. Dies führte zur Identifizierung von muskelbezogenen Phänotypen für csf1b, wif1, welche sekretierte Signalmoleküle bzw. –modulatoren kodieren, für cdon, A2CEY7, die Zelloberflächenproteine kodieren, sowie für fmod, thbs4b, tnw und oflml2b, die Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) kodieren. Während einige dieser Knockdowns die myogene Linie primär auf der Ebene der Muskelstammzellen betreffen, scheinen andere hauptsächlich die Funktion der Myoblasten oder die Anheftung der Muskelfasern an die extrazelluläre Matrix zu beeinträchtigen.

Die AVEXIS Plattform wurde genutzt, um durch eine systematische Suche neue extrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen MSC-sekretierten Proteinen und Zelloberflächenproteinen, Liganden und ECM-Komponenten zu finden. Die Kombination von funktionellen und biochemischen Daten führte zu unterschiedlichen Projekten, deren Kernbeobachtungen im Folgenden kurz umrissen werden sollen:

• Tenascin W (Tnw) – ein MSC-sekretiertes ECM-Molekül, welches stark in humanen Glioblastomen und anderen Tumoren des Gehirns, der weiblichen Brust und des Dickdarms exprimiert ist – interagiert mit den Notch-Liganden DeltaA und B. Knockdown von Tnw führt zu einem deutlichen Absinken der MSC-Zahl resultierend aus der illegitimen Aktivierung und vorzeitigen Differenzierung von MSCs. Diese Ergebnisse etablieren Tnw – einen der spezifischsten Marker menschlicher Krebserkrankungen als MSC-sekretiertes MSC-Nischenmolekül und implizieren Tenascin W als Komponente des Notch-Signalwegs.

• csf1b ist eines der am stärksten hochregulierten Gene in den MSCs der Knochenfische. Die Paraloge, die Csf1a und Csf1b, sowie den Csf1r-Rezeptor kodieren, sind im Verlauf der Evolution der Knochenfische in Bezug auf ihre Expression und Funktion divergiert. Die Aktivität des pax7 Reporters ist stark reduziert in den Xanthophoren von csf1ra Mutanten (pfeffer), was daraufhin- weist, daß Csf1 die Expression von Pax7 in Zellen der Neuralleiste und möglicherweise auch in Zellen der myogenen Linie steuert.

• Das GPI-verankerte Zelloberflächenmolekül A2CEY7 ist eine bona fide neue und essentielle Komponente des Hh-Signalwegs.

• Seraf, ein ’orphan ligand’, der im Dermomyotom und später durch MSCs exprimiert wird, bindet an den FGF Rezeptor FGFR4. Die Interaktion mit FGFR4 konstituiert eine autokrine Schleife. Neben der Interaktion mit FGFR4 konnten zwei weitere Interaktionen mit dem extrazellulären ’hub protein’ Opticin und dem Transmembranprotein Kon-Tiki 3/Cspg4 gefunden werden.