Histone H3 and its Centromeric Variant Cse4 Co-Occupy the Centromeric DNA in Saccharomyces cerevisiae

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-64826
http://hdl.handle.net/10900/49743
Dokumentart: PhDThesis
Date: 2012
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Ivanov, Dmitri (Dr.)
Day of Oral Examination: 2012-10-16
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Nucleosom , Histone , Chromatin , DNS , Bäckerhefe
Other Keywords: ChIP , Zentromer , Saccharomyces cerevisiae , Kinetochor , CENP-A
Centromere , Kinetochore , Histone H3 variant , CENP-A , Nucleosome
License: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

Für die Zellteilung muss die replizierte genetische Information einer Zelle korrekt auf die entstehenden Tochterzellen aufgeteilt werden. Die DNS wird dafür in Schwesterchromatiden verpackt, welche mit Hilfe von Mikrotubuli zu den entgegengesetzten Zellpolen gezogen werden. Die Mikrotubuli sind dafür mit den Zentromeren der Schwesterchromatiden über einen Multiproteinkomplex, dem Kinetochor, verbunden. Der Aufbau des Kinetochors findet gezielt an dem speziellen Chromatin des Zentromers statt. Kanonisches Chromatin besteht aus Nukleosomen, welche aus je zwei Molekülen der Histone H3, H4, H2A und H2B zusammengesetzt sind und diese Proteinoktamere sind von 147 bp DNS in 1.7 Windungen umwickelt. Im Vergleich dazu enthalten zentromere Nukleosomen die Histon H3 Variante CENP-A und es gibt die Auffassung, dass diese Nukleosomen kein Histon H3 beinhalten. CENP-A ist ein essentielles Protein, welches unerlässlich ist für den Aufbau des Kinetochors. Homologe Proteine von CENP-A wurden in allen untersuchten Eukaryoten entdeckt. Während höhere Eukaryoten lange Reihen (kbp bis Mbp DNS) von zentromeren Chromatin mit CENP-A Nukleosomen besitzen, hat die zentromere DNA der Sprosshefe nur eine länge von ungefähr 125 bp mit einem einzigen Cse4 (Sprosshefehomolog von CENP-A) beinhaltendem zentromeren Nukleosom. Dieses Nukleosom ist ausreichend um Kinetochorproteine zu rekrutieren und den Multiproteinkomplex aufzubauen. Bei diesem sogenannten Punktzentromer nimmt man an, dass es die kleinste Einheit von größeren Zentromeren darstellt. Allerdings wird der genaue Aufbau des speziellen zentromeren Nukleosoms mit verschiedenen, einander widersprechenden Modellen kontrovers diskutiert. Wir haben eine neuartige Chromatinimmunopräzipitationstechnik (ChIP) entwickelt um den exakten Aufbau des zentromeren Nukleosoms in Sprosshefe zu untersuchen. Dieser neue ChIP-Ansatz basiert auf der Anwendung eines zentromeren DNS-Fragments, das zu kurz ist um mehr als einem Nukleosom Platz zu bieten. Unsere Ergebnisse bestätigten die Assoziation von CENP-A (Cse4), Histon H4, H2A und H2B mit der zentromeren DNS. Jedoch entdeckten wir auch eine starke Interaktion von Histon H3 mit diesem DNS-Fragment. Mit der Durchführung eines sequenziellen ChIP-Ansatzes konnten wir zudem zeigen, dass Histon H3 und CENP-A (Cse4) gleichzeitig mit der zentromeren DNS assoziiert sind. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei dem zentromeren Nuklesom in Sprosshefe um ein heterotypisches Nukleosom, mit je einem Molekül Histon H3 und CENP-A (Cse4) handelt. Zukünftige Modelle müssen Histon H3 in den Aufbau des zentromeren Nukleosomes mit einbeziehen.

Abstract:

For cell division, the replicated genetic information of a cell needs to be accurately segregated to the emerging daughter cells. This is achieved by packaging the DNA into sister chromatids, which are separated by the poleward pulling force of microtubules. Microtubules are attached to the centromeres of the sister chromatids by a multi-protein complex called the kinetochore. The assembly of the kinetochore at the centromere is directed by specialized centromeric chromatin. Conventional chromatin contains nucleosomes, which are comprised of two copies each of the histones H3, H4, H2A, and H2B. This protein octamer organizes 147 bp of DNA by wrapping it in 1.7 turns. In contrast to canonical nucleosomes it is believed that centromeric nucleosomes are devoid of histone H3 and contain in its place the variant CENP-A. CENP-A is an essential protein necessary for kinetochore formation and homologues have been identified in all eukaryotes studied so far. Whereas higher eukaryotes have long arrays (kilo- to megabases of DNA) of centromeric chromatin with CENP-A containing nucleosomes, the budding yeast centromeric DNA is approximately 125 bp with only a single Cse4 (budding yeast homologue of CENP-A) containing nucleosome that is sufficient to recruit and assemble the kinetochore. This so-called point centromere is thought to represent the smallest unit of larger centromeres. However, the exact composition of this special centromeric nucleosome is subject of intensive debate with contradicting models proposed. We investigated the exact composition of the centromeric nucleosome in budding yeast by developing a novel chromatin immunoprecipitation technique. This ChIP approach was based on the use of a centromeric DNA fragment that is too short to accommodate more than a single nucleosome. Not only did we observe the interaction of CENP-A (Cse4), histones H4, H2A, and H2B with the centromeric DNA, we also discovered a strong association of histone H3 with this fragment. By employing a sequential ChIP approach we could show that histone H3 and CENP-A (Cse4) are co-occupying the centromeric DNA. Our experimental evidence supports the view of a heterotypic H3/CENP-A (Cse4) nucleosome at the centromere and all future models need to account for the presence of histone H3 at the centromeric DNA.

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