The Drosophila neuromuscular junction as a model system to study the molecular mechanisms of neurodevelopment and synaptic degeneration

Abstract

More than a century ago the fruit fly Drosophila melanogaster was established as a genetic model system. The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has proven as an adequate model system to study molecular mechanisms of development of glutamatergic synapses. Discoveries first made in flies had a brought impact on neuroscience research in vertebrates, as many genes and fundamental aspects of cell biology are conserved between Drosophila and vertebrates. In addition, Drosophila has established as an expedient model system in the study of human neurodegeneration during the last two decades. The first chapter of this thesis focuses on the role of the protein phosphatase 2A (PP2A) in the development of individual synapses at the Drosophila NMJ. The Drosophila NMJ is organized in a chain of boutons, each bouton containing 10-50 individual synapses. Within each synapse the presynaptic active zone protein Bruchpilot (Brp) is directly apposed to a cluster of postsynaptic glutamate receptors (GluR). The postsynaptic clustering of GluR precedes the presynaptic localization of Brp, but within ten hours after GluR clustering Brp is localized at the apposing active zone. When PP2A was inhibited, about 30% of the GluR clusters were found to be unapposed to the presynaptic Brp. These GluR clusters were almost threefold smaller than GluR clusters apposed to Brp and were more prevalent in the distal boutons of the NMJ. In vivo imaging of GluR clustering further revealed that within six hours of development almost no new GluR clusters formed when PP2A was inhibited. Thus neuronal inhibition of PP2A impairs presynaptic maturation of synapses and causes additional defects in postsynaptic development. The second and central part of this thesis focuses on the establishment of a Drosophila model of the degenerative motor-neuron disorder hereditary spastic paraplegia (HSP). The common pathological feature, of this group of clinically and genetically heterogeneous disorders, is a progressive retrograde axonopathy of the longest corticospinal motor-neurons. Here we establish a Drosophila model for the HSP subtype SPG10. The SPG10 gene encodes the neuron specific kinesin heavy chain KIF5A of vertebrate kinesin-1. To model SPG10 in Drosophila, the HSP-associated mutation N256S in human KIF5A was introduced into Drosophila Khc at the corresponding site (N262S) and the mutated KhcN262S was expressed in a Drosophila wild-type background. This Drosophila SPG10 model recapitulates key disease features of HSP such as impairments in locomotion, axonal swellings, degeneration of synapses and a more severe affliction of longer axons. We show that KhcN262S acts as a dominant-negative allele in vivo. Furthermore our data suggest that the pathology in the Drosophila SPG10 model establishes due to impaired localization of cargo necessary for maintenance of structure and/or function of the synapses or the axon. As possible mechanisms contributing to pathology in the Drosophila SPG10 model reduced mitochondrial density at the NMJ, a reduction in bone morphogenetic protein (BMP) signaling and alterations in axonal as well as neuromuscular cytoskeleton were identified. All of these findings have been linked to neurodegenerative disorders before. The presented Drosophila SPG10 model provides a valuable tool for continuative studies of the mechanisms of initiation and progression of pathology in the HSP subtype SPG10.

Vor über einem Jahrhundert hat sich die Fruchtfliege Drosophila melanogaster als genetisches Modelsystem etabliert. Die neuromuskuläre Verbindung in Drosophila hat sich als geeignetes Modelsystem zur Untersuchung molekularer Mechanismen der Entwicklung glutamaterger Synapsen erwiesen. In Drosophila gemachte Entdeckungen waren von großer Bedeutung für die neurowissenschaftliche Forschung in Vertebraten, da Gene und wesentliche Aspekte der Zellbiologie konserviert sind zwischen Drosophila und Vertebraten. Innerhalb der letzten 20 Jahre hat sich Drosophila zudem als ein nützliches Modelsystem zur Untersuchung humaner neurodegenerativer Erkrankungen etabliert. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle der Proteinphosphatase 2A (PP2A) in der Entwicklung einzelner Synapsen an der neuromuskulären Verbindung in Drosophila. Die Drosophila neuromuskuläre Verbindung besteht aus einer Kette von Boutons, wobei jeder Bouton 10-50 individuelle Synapsen enthält. An den einzelnen Synapsen liegen sich die präsynaptischen aktiven Zonen, markiert durch das Protein Bruchpilot (Brp), und die postsynaptischen Glutamatrezeptorfelder (GluR) gegenüber. Daher ist jede einzelne Synapse gekennzeichnet durch die präsynaptische Lokalisation von Brp und die gegenüberliegende postsynaptische Lokalisation von GluR. Bei der Entstehung einer neuen Synapse geht das Clustern der postsynaptischen GluR-Felder der präsynaptischen Lokalisation von Brp voraus, die spätestens innerhalb von zehn Stunden nach dem Clustern der GluR erfolgt. Wurde die Funktion von PP2A inhibiert, waren dagegen etwa 30% der GluR-Felder nicht von präsynaptischem Brp opponiert. Diese GluR-Felder befanden sich vor allem in den distalen Boutons der neuromuskulären Verbindung und waren etwa dreimal kleiner als GluR-Felder welche präsynaptischem Brp gegenüberlagen. Untersuchung der Dynamik von GluR-Feldern in vivo über einen Zeitraum von sechs Stunden zeigte dass fast keine neuen GluR-Felder gebildet wurden wenn die Funktion von PP2A inhibiert war. Unsere Ergebnisse zeigen dass die neuronale Inhibierung von PP2A die präsynaptische Reifung einzelner Synapsen negativ beeinflusst und zusätzlich einen Einfluss auf die Entwicklung der Postsynapse hat. Der zweite und zentrale Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Etablierung eines Drosophila Models für die degenerative Motorneuronen Erkrankung Hereditäre Spastische Spinalparalyse (HSP). Diese Gruppe von Erkrankungen ist gekennzeichnet durch eine progressive retrograde Degeneration der längsten Axone des corticospinalen Traktes im Menschen. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit haben wir ein Drosophila Model für den HSP Subtyp SPG10 etabliert. Das SPG10 Gen codiert für eine neuronale Form der schweren Kette des Kinesin-1 in Vertebraten, KIF5A. Für das Drosophila SPG10 Model wurde die im humanen KIF5A vorkommende, HSP assoziierte Mutation N256S in die schwere Kette (Khc) des Drosophila Kinesin-1 an korrespondierender Stelle (N262S) eingeführt und das mutierte KhcN262S in einem wild-type Hintergrund in Drosophila exprimiert. Das Drosophila SPG10 Model rekapituliert charakteristische HSP Merkmale, wie eine Beeinträchtigung der Lokomotion, axonale Schwellungen, synaptische Degeneration sowie eine schwerwiegendere Beeinträchtigung längerer Axone. Zudem konnten wir zeigen dass KhcN262S dominant negativ auf wild-type Khc in vivo wirkt. Des weiteren deuten unsere Daten an, dass die im Drosophila Model beobachtete Symptomatik durch das Fehlen eines bestimmten Cargos an der Synapse verursacht wird, welches möglicherweise für die Aufrechterhaltung der Funktion und/oder Struktur von Synapse und Axon notwendig ist. Zudem wurden weitere Mechanismen identifiziert welche eine mögliche Rolle in der Entwicklung der Pathologie im Drosophila Model spielen. So wurden eine stark reduzierte Mitochondriendichte an der neuromuskulären Verbindung, eine Beeinträchtigung des neuronalen BMP Signalweges sowie Veränderungen des neuromuskulären und axonalen Zytoskelettes beobachtet. Diese Mechanismen sind in anderen Studien als mögliche Ursachen mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Das hier vorgestellte SPG10 Drosophila Model stellt ein wertvolles Hilfsmittel dar, um in weiteren Untersuchungen weiterführende Einsichten in die Mechanismen des Beginns und der Weiterentwicklung der SPG10 Pathologie zu gewinnen