Evidence for an Enzymatic Activity of Exuperantia Necessary for bicoid mRNA Localization

Abstract

The anterior localization of bicoid mRNA in the Drosophila oocyte is a prerequisite for the establishment of the anterior-posterior axis later in the embryo. Few factors are known to be essential for this process. Aside from swallow, staufen and the ESCRTII, all of which are important for late steps in bicoid mRNA localization, the only early acting factor is exuperantia. Previous work has shown that Exuperantia needs to be present in the nurse cells to promote anterior localization of bicoid mRNA after transport into the oocyte. In exu-mutant flies bicoid mRNA is transported into the oocyte but cannot localize specifically. So far, the molecular function of Exuperantia is not understood and it is unclear how Exuperantia modifies bicoid mRNA in the nurse cells. Previously, two phosphorylation sites in the C-terminal part had been identified, but they are dispensable for Exuperantia's role in bicoid mRNA localization. In addition, an alignment of Exuperantia’s N-terminus with exonucleases was published in 1997, but this finding was not followed up. Within this thesis a SAM-like domain in the central part of Exuperantia was identified, and there is evidence that this domain might be RNA-binding. Furthermore, the homology to exonucleases was confirmed and a DEDD exonuclease domain (SCOP family c.55.3.5) was characterized in the N-terminus of Exuperantia. Biochemical in-vitro assays with recombinant proteins confirm the importance of these domains and hint at an enzymatic function of Exuperantia. Using transgenes encoding Venus-tagged proteins, I show that residues, which are known to be essential for the catalytic activity of this family of enzymes, are important in-vivo for Exuperantia's role in bicoid mRNA localization. This suggests that it might be an enzyme with exonuclease activity, which would explain why the protein co-localizes with bicoid mRNA only transiently. Interestingly, bicoid mRNA itself does not seem to be the target of this enzymatic activity. The transgenes coding for enzymatic inactive proteins described in this thesis can be used as tools and should allow the identification of the in-vivo targets of Exuperantia.

Die anteriore Lokalisierung von bicoid mRNA in der Eizelle von Drosophila ist eine notwendige Voraussetzung für die Etablierung der anterior-posterioren Achse später im Embryo. Es sind nur wenige Faktoren bekannt, die für diesen Prozess der RNA Lokalisierung essentiell sind. Abgesehen von swallow, staufen und dem ESCRTII, die für die späteren Schritte der bicoid mRNA Lokalisierung notwendig sind, ist der einzig bekannte frühe Faktor exuperantia. Frühere Arbeiten zeigten, dass Exuperantia in den Nährzellen der Eikammer aktiv sein muss, um die Lokalisierung von bicoid mRNA in der Eizelle zu beeinflussen. In exu-mutanten Fliegen wird bicoid mRNA noch in die Eizelle transportiert, kann später aber nicht anterior lokalisieren. Die molekulare Funktion von Exuperantia ist bislang nicht verstanden, und es ist nicht bekannt, wie Exuperantia bicoid mRNA in den Nährzellen modifiziert. Bisher waren zwei Phosphorylierungsstellen im C-Terminus identifiziert worden, diese sind jedoch entbehrlich für Exuperantias Funktion in der Lokalisierung von bicoid mRNA. Außerdem wurde im Jahr 1997 ein Sequenz-Alignment des amino-terminalen Teils von Exuperantia mit Exonukleasen publiziert, was jedoch bislang nicht weiter untersucht worden war. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine SAM-ähnliche Domäne im mittleren Teil des Proteins identifiziert werden, und es fanden sich Hinweise darauf, dass diese SAM-ähnliche Domäne möglicherweise eine RNA-bindende Funktion hat. Darüber hinaus konnte die Homologie zu Exonukleasen bestätigt werden, und es wurde eine DEDD Exonukleasedomäne (SCOP Familie c.55.3.5) im N-terminalen Bereich von Exuperantia charakterisiert. Durch die Verwendung von Transgenen konnte nachgewiesen werden, dass Aminosäure-Reste, die für die katalytische Aktivität dieser Enzym-Familie essentiell sind, auch für die in-vivo Funktion von Exuperantia eine wichtige Rolle spielen. Die Analyse der transgenen in Fliegen weist darauf hin, dass Exuperantia ein exonukleolytische Enzym ist. Dies könnte erklären, warum Exuperantia nur transient mit bicoid mRNA ko-lokalisiert. Interssanterweise haben Versuche innerhalb dieser Arbeit gezeigt, dass bicoid mRNA selbst nicht das Ziel dieser enzymatischen Aktivität zu sein scheint. Die hier beschriebenen Transgene, die für katalytisch inaktive Proteine codieren, können in weiteren Versuchen eingesetzt werden, um die in-vivo Substrate von Exuperantia zu finden.