Co-Transport of mRNA and ER in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

The localization of mRNAs is a mechanism that is widely spread in most of the eukaryotic cells to spatially define protein synthesis and thus contributes to maintenance and generation of cellular asymmetry, neuronal function and embryonic development. In budding yeast localized mRNAs are forming RNA-protein (RNP) complexes with the mRNA-binding protein She2p, the adaptor protein She3p, that is also known to bind to mRNAs and the motor protein She1p (Myo4p). The mRNA binds to She2p by its cis-acting elements (zipcodes) and She2p is then associated to Myo4p via She3p that acts as an adapter. The Myo4p-She3p co-complex that is an important part of the core locasome and thus essential for the mRNA localization machinery is also involved in the inheritance of cortical ER (cER; Estrada P. et al., 2003). The mRNP is transported towards the barbed ends of actin cables consisting of actin molecules and tropomyosin filaments located at the bud tip. The process by which the mRNAs are anchored at the bud tip is unknown (Jansen R.P. et al., 1996; Gonsalvez G.B. et al., 2005). This She1-3 machinery is known to localize about 24 mRNAs to the bud tip including 16 mRNAs that encode secreted or membrane proteins like the aforementioned IST2 mRNA or the She2p transport-dependent EAR1 mRNA (Giaever G. et al., 2002; Terashima H. et al., 2002; Leon S. et al., 2008). RNP particles form the initial element for the segregation of cER. The fact that RNPs can localize together with tubular ER structures was also supported by the ASH1 mRNA which binds to the tip of ER-membrane tubules (Schmid M. et al., 2006) suggesting a coordination of mRNA localization and cER distribution. This study demonstrates that mutants that are defective on ER segregation and morphology are at the same time affecting mRNA localization of early expressed mRNAs. This indicates a direct link between mRNA localization and ER inheritance. It was shown that the RNA-binding protein She2p associates independently of polysomes with ER membranes. This and the mRNP localization experiments with WSC2 mRNA demonstrate that the mRNA localization occurs independent on its translation. Based on this study it was shown that the proper segregation of cER is essential for the localization of a subset of mRNAs that are transported early during cell growth and then get expressed at the time of tubular ER movement into the bud. Thus, a new model of early and late mRNA localization pathways linked to ER inheritance during the early stages of budding was established. mRNAs that are expressed early during the cell cycle are therefore co-localized with the ER, while late expressed mRNAs are localized towards the bud ER-independently. This temporally split mRNA localization represents the most time and energetically efficient transport mechanism during budding. Altogether, this study confirmed the hypothesis of a link between mRNA localization and ER transport. Additionally, this study confirms that the tetramerization of She2p, the basic helical hairpin motif and the helix E (Niessing D. et al., 2004; Müller M. et al., 2011) are essential for the proper co-localization of tubular ER and RNPs that are depending on She2p. The mRNA-binding protein She2p can bind to artificial and protein-free liposomes depending on their curvature with a preference to a diameter of 30 nm comparable to the diameter of ER tubules in yeast. Because of the fact that the binding of She2p to membranes is saturable, She2p has an unexpected membrane binding property and thus is a likely candidate for the association of specific mRNAs to ER tubules. She2p is therefore not only a protein that binds mRNA in the nucleus and thus initiates the mRNA transport mechanism but is also able to bind to liposomes and therefore can also be characterized as a lipid-binding protein that recognizes membrane curvature. So She2p is an ideal coordinator of mRNA transport and ER tubules.

Die mRNA-Lokalisierung ist ein Mechanismus der in den meisten eukaryotischen Zellen verbreitet ist und dazu dient die Proptein-Synthese räumlich festzulegen. Somit trägt die mRNA-Lokalisation trägt somit zur Zellasymmetrie, zelleigenen Überprüfung, neuronalen Funktionen und der embryonischen/embryonalen Entwicklung bei. In der knospenden Hefe bilden die zu lokalisierenden mRNAs sogenannte RNA-Protein (RNP) Komplexe mit dem RNA-bindenden Protein She2p, dem als Adapter fungierenden Protein She3p, welches ebenso die Fähigkeit besitzt mRNA zu binden, und dem Motorprotein She1p/Myo4p. Dabei bindet die mRNA über die cis-Elemente, auch Zipcodes genannt, an She2p welches dann wiederum über den Adapter She3p an Myo4p bindet. Der Myo4p/She3p co-Komplex, welcher ein wichtiger Bestandteil des sogenannten Kern-Locasoms darstellt und somit notwendig für die mRNA Lokalisierungsmaschinerie ist, ist auch an der Weitergabe und damit der Vererbung des kortikalen Endoplasmatischen Retikulums (cER) beteiligt (Estrada P. et al, 2003). Der mRNP Komplex wird zu den Enden der Aktinkabel transportiert, welche aus Aktinmolekülen und Filamenten aus Tropomyosin bestehen und sich an der Knospenspitze befinden. Wie genau dabei die mRNA an die Knospe der neuen Tochterzelle verankert wird ist bis jetzt unbekannt (Jansen R.P. et al, 1996; Gonsalvez G.B. et al, 2005). Für die She1-3 Maschinerie ist bisher bekannt, dass sie 24 mRNAs zur Knospenspitze lokalisiert. 16 dieser 24 mRNAs kodieren dabei für Sekretions- oder Membranproteine wie die bereits erwähnte IST2 mRNA oder die She2p transportunabhängige EAR1 mRNA (Giaever G. et al, 2002; Terashima H. et al, 2002; Leon S. et al, 2008). RNP Partikel bilden das initiative Element für die Abtrennung von cER. Die Tatsache, dass RNPs zusammen mit röhrenförmigen ER Strukturen lokalisieren können, welches am Beispiel der ASH1 mRNA gezeigt werden konnte indem die ASH1 mRNA an die Spitze von ER Membranröhren bindet (Schmid M. und al, 2006), stellte einen der ersten wichtigen Hinweise für eine Koordination der mRNA Lokalisierung und des cER Verteilung dar. Mit Hilfe meiner/dieser Studie konnte gezeigt werden, dass Mutanten von Hefezellen, welche einen Defekt in der ER Segregation aufweisen gleichermaßen auch einen Defekt für die Lokalisierung von früh exprimierten mRNAs aufweisen. Dies zeigt, dass eine direkte Verbindung zwischen mRNA Lokalisierung und der Vererbung und somit Weitergabe des ER besteht. Ebenso konnte gezeigt werden, dass das RNA bindende Protein She2p unabhängig von Polysomen mit dem ER assoziiert. Dies und die mRNP Lokalisierungsexperimente mit WSC2 mRNA demonstrieren, dass die mRNA Lokalisierung als solche translationsunabhängig ist. Beruhend auf meiner Studie konnte gezeigt werden, dass die korrekte Segregation des cER für die Lokalisierung einer bestimmten Anzahl von mRNAs notwendig ist, welche früh während des Zellwachstums transportiert werden und dann zur selben Zeit wie der Vererbung tubulären ERs in die Knospe lokalisiert werden. Somit konnte ein neues Modell von frühen und späten mRNA Lokalisierungswegen, welche mit der ER Vererbung während der frühen Stadien des Knospens verbunden sind, erstellt werden. mRNAs, welche früh während des Zellzyklus exprimiert werden, werden mit dem ER co-lokalisiert während mRNA, die spät im Zellzyklus exprimiert werden, ER unabhängig lokalisiert werden. Diese zeitlich unterteilte mRNA Lokalisation repräsentiert einen möglichst temporär und energetisch effizienten Transportmechanismus während des Knospens der Hefezelle. Zusammenfassend bestätigt diese Studie somit die Hypothese, dass es eine direkte Verbindung zwischen der mRNA Lokalisierung und dem ER-Transport gibt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Tetramerization von She2p, dem elementaren spiralförmigen Haarnadel-Motiv und die Helix E (Niessing D. und al, 2004; Müller M. und al, 2011) essentiell für die korrekte co-Lokalisierung von tubulärem ER und RNPs notwendig sind, welche somit She2p abhängig ist. Das mRNA-bindende Protein She2p ist zudem in der Lage an künstliche und proteinfreie Liposomen, abhängig von ihrer Krümmung, binden. Bevorzugt erfolgte dabei eine Bindung an Liposomen mit einem Durchmesser von 30 nm, was dem Durchmesser von ER Röhren in Hefe entspricht. Aufgrund der Tatsache, dass die Bindefähigkeit von She2p zu Membranen gesättigt werden kann, zeigt, dass She2p eine unerwartete Membran-Bindefähigkeit besitzt und somit einen wahrscheinlichen Kandidaten für die Assoziation spezifischer mRNAs an ER Strukturen repräsentiert. She2p ist daher nicht nur ein Protein, welches die mRNA im Zellkern bindet und so den mRNA-Transportmechanismus startet, sondern auch in der Lage ist an Liposomen zu binden. Daher kann She2p auch als ein lipid-bindendes Protein charakterisiert werden, welches die Membranenkrümmung erkennt. Somit ist She2p ein idealer Koordinator des mRNA-Transports zusammen mit dem ER.