Ca2+ Activated Cl- Channel ANO6 and Voltage Gated Proton Channel Hv1 in Dendritic Cell Functions

Abstract

Dendritic cells (DCs) belong to the family of antigen presenting cells, located at the center of immunological responses, which decide on induction of tolerance or specific immunity. A whole variety of DC functions, for example their activation, migration and maturation, is regulated by Ca2+ signaling. Intracellular Ca2+ levels are tightly regulated through various mechanisms, which include diverse ion channels that control membrane potential sustaining or decreasing the driving force for Ca2+. The first aim of the present investigation was to determine whether DCs express functional Ca2+ activated Cl- channels, their molecular identity and a possible role in DC functions. In whole cell patch clamp experiments on mouse bone marrow-derived DCs, increase in intracellular Ca2+ levels induced by intracellular IP3, extracellular ionomycin in the presence of Ca2+ or by ligation of the chemokine receptor CCR7 resulted in the activation of the outwardly rectifying Cl- channels (CaCCs). Anoctamine 6 (ANO6) was identified as the molecule responsible for the formation of CaCCs in DCs, as demonstrated by the whole cell patch clamp experiments in DCs upon ANO6 knock down by siRNA. Furthermore, when ANO6 was silenced, DC migration efficiency significantly decreased suggesting that the activity of ANO6 plays a major role in the regulation of DC migration. Another crucial function of DCs is their ability to uptake and process antigens during phagocytosis. The NADPH oxidase NOX2 regulated phagocytosis is a major mechanism that accounts for the highly controlled protein degradation in phagolysosomes. Continuous activity of NOX2 requires pH and charge compensation, both of which are provided in other cell types by the work Hv1 proton channel. In the present study on mouse bone marrow-derived DCs functional expression of Hv1 channel was demonstrated. LPS was shown to regulate Hv1 in a bimodal way, with acute, PKC dependent induction of the enhanced gating mode of the channel, followed by a strong inhibition of Hv1 currents in LPS (24 h) matured cells. Those Hv1 responses were paralleled with correspondent changes in NOX2 activity: acute NOX2 stimulation by LPS as measured by LPS induced electron currents and impaired NOX2 activity in LPS (24 h) matured DCs, as assessed by a decreased ROS production. Therefore, Hv1 functions as a regulator of NOX2 dependent phagocytosis in DCs.

Dendritische Zellen (DCs) gehören zu den Antigen-präsentierenden Zellen und stehen im Zentrum der Immunantwort. Sie entscheiden zwischen der Induktion von Immuntoleranz oder der Ausprägung spezifischer Immunität. Eine Reihe unterschiedlicher Funktionen von DCs, wie ihre Aktivierung, Migration und Reifung wird durch Ca2+-Signale reguliert. Intrazelluläre Ca2+-Level werden eng durch verschiedene Mechanismen kontrolliert, die die Aktivität verschiedener Ionenkanäle einschließt. Letztere determinieren das Membranpotenzial oder modulieren die elektrochemische Triebkraft für die Transmembran-Ca2+-Flüsse. Als erstes Ziel der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, inwieweit DCs Ca2+-aktivierte Cl--Kanäle funktionell exprimieren. Bei einer vorliegenden Expression dieser Kanäle sollte die molekulare Identität und mögliche Funktion dieser Kanäle definiert werden. In Ganzzell Patch Clamp-Experimenten an DCs, die aus Mausknochenmark gewonnen wurden (mBMD-DCs), ließen sich durch Erhöhung der zytoplasmatischen freien Ca2+-Konzentration mittels intrazelluläres IP3, Ca2+-Permeabilisierung der Plasmamembran durch Ionomycin oder Ligation des Chemokin-Rezeptors CCR7 auswärts gleichrichtende Cl--Kanäle (CaCCs) aktivieren. Anoctamine 6 (ANO6) konnte als dasjenige Molekül identifiziert werden, das die CaCCs in DCs bildet. Dies wurde durch Ganzzell Patch Clamp-Ableitungen nach ANO6-Knock down in siRNA-Experimenten nachgewiesen. Silencing von ANO6 verminderte zudem die DC-Migrationseffizienz signifikant, was darauf hindeutet, dass die Aktivität von ANO6 eine wichtige Rolle bei der Regulation der DC-Migration spielt. Die Fähigkeit der Aufnahme und Prozessierung von Antigenen während der Phagozytose stellt eine weitere, wesentliche Funktion von DCs dar. Die Phagozytose, die durch die NADPH-Oxidase NOX2 reguliert wird, ist wiederum ein entscheidender initialer Prozess für die spätere hoch-kontrollierte Protein-Degradation im Phagolysosom. Die fortlaufende Aktivität der NOX2 kann nur bei ständiger pH und Ladungskompensation stattfinden. Für beide Prozesse wurden in andern Zelltypen Hv1 Protonen-Kanäle verantwortlich gemacht. Die vorliegende Arbeit konnte in mBMD-DCs die funktionelle Expression von Hv1-Kanälen nachweisen. Es zeigte sich, dass Lipopolysaccharid (LPS) Hv1-Kanäle in einer bimodalen Weise reguliert: einem, nach akuter LPS-Stimulation erhöhten Gating des Kanals, das Protein Kinase C (PKC)-abhängig war, folgte eine starke Inhibition der Hv1-Ströme in LPS (24 h)-gereiften DCs. Diese Hv1-Antworten wurden begleitet von entsprechenden Änderungen der NOX2-Aktivität: LPS induzierte akut eine NOX2-Stimulation, die als LPS-induzierter Elektronen-Strom nachweisbar war. In LPS (24 h)-gereiften DCs dagegen war die NOX2-Aktivität abgeschwächt, wie eine verminderte ROS-Produktion zeigte. Draus lässt sich schließen, dass Hv1 in DCs die NOX2-abhängige Phagozytose als initialen Schritt der Antigen-Prozessierung reguliert.