Regulation of Potassium Channels through mTOR and PDK1 in Dendritic and Mast Cells

Abstract

Dendritic cells are antigen-presenting cells, central for the development of optimal T cell immunity, that are able to initiate primary immune responses and to establish immunological memory. Mast cells are tissue-based effector cells in allergic diseases, playing a central role in the propagation of IgE-dependent allergic reactions, such as allergic rhinitis, asthma, anaphylaxis and delayed hypersensitivity reactions. Upon stimulation of IgE receptors , mast cells release granules containing several mediators including histamine and cytokines, which regulate responses of other inflammatory cells. Dendritic and mast cell functions are regulated by phosphatidylinositol-3 (PI3) kinase signalling pathway.. The PI3 kinase is partially effective in dendritic and mast cells through alteration of their ion channel activity. Both PI3 kinase on the one hand and ion channels on the other hand are important for the regulation of mast and dendritic cell functions. However, little is known about downstream elements of the PI3 kinase that regulate ion channels in those cells. In the present project the question was addressed whether two PI3 kinase downstream targets, phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1) and mammalian target of rapamycine (mTOR), regulate ion channels and ion channel-dependent functions in dendritic and mast cell. We showed that treatment of dendritic cells with rapamycine, the mTOR inhibitor, led to inhibition of the currents through voltage-gated K+ channels, which in dendritic cells belong to Kv 1.3 and Kv 1.5 families. Analysis of the time constants of activation and inactivation demonstrated that rapamycin caused faster Kv channel inactivation. To test the hypothesis that Kv1.3 and/or Kv1.5 channels could be regulated by mTOR, cRNA encoding Kv1.3 or Kv1.5 was injected into Xenopus oocytes with or without additional injection of cRNA encoding mTOR. The Kv1.3 and Kv1.5 currents were significantly increased by additional coexpression of mTOR, an effect abolished by rapamycin. Analysis of activation and inactivation time constants of Kv1.3 and Kv1.5 revealed that mTOR affected tau activation and tau inactivation of Kv1.3, but not of Kv1.5. Coexpression with mTOR resulted in a decreased tau activation and an increased tau inactivation of Kv1.3, suggesting that mTOR causes faster Kv1.3 channel activation and slower Kv1.3 channel inactivation. We were interested to analyze whether rapamycin has also effects on non-voltage gated K+ channels. We performed experiments in mouse bone marrow-derived mast cells (BMMCs), which are known to express Ca2+-activated K+ channels KCa3.1. Our observations demonstrated that though rapamycine did not influence KCa3.1 channel activation directly, it impaired antigen-dependent increase of cytosolic Ca2+ in BMMCs and that secondary led to the blunted activation of the KCa3.1 channels. In BMMC we also studied the effect of another kinase of the PI3 kinase pathway, PDK1, on ion channels and cell functions. The present study demonstrated that the stimulation of Ca2+ entry, but not Ca2+ release from intracellular stores, following exposure to antigen was significantly less pronounced in mast cells from PDK1 hypomorphic mice (pdk1hm) than in mast cells from their wild type littermates (pdk1wt). PDK1 deficiency thus blunted Ca2+ entry and consequently indirectly also the currents through Ca2+-activated K+ channels KCa3.1. Partial PDK1 deficiency did not abrogate degranulation despite the reduced Ca2+ entry in pdk1hm BMMCs. Both ß-hexosaminidase release and histamine release were not significantly different between pdk1wt and pdk1hm BMMCs. We provided a possible mechanism explaining unaffected degranulation in pdk1hm BMMCs by showing that PDK1 led to the activation of two downstream kinases, SGK1 and PKCdelta;, positive and negative regulators of mast cell degranulation, respectively.

Dendritische Zellen sind Antigen-präsentierende Zellen, die zentral in der Entwicklung einer optimalen T-Zell-Immunität stehen. So können sie primäre Immunantworten einleiten und ein immunologisches Gedächtnis aufbauen. Mastzellen sind im Gewebe beheimatete Effektorzellen, die eine zentrale Rolle bei der Ausweitung IgE-abhängiger allergischer Reaktionen einnehmen, wie zum Beispiel bei allergischer Rhinitis, Asthma, Anaphylaxie und verzögerten Hypersensitivitätsreaktionen. Nach der Stimulation von IgE-Rezeptoren setzen Mastzellen Granula mit verschiedenen Mediatoren frei, unter anderem Histamine und Zytokine, welche die Antworten anderer inflammatorischer Zellen regulieren. Die Funktionen von dendritischen und Mastzellen werden über den Phosphatidylinositol-3 (PI3) Kinase Signalweg reguliert. Der PI3 Kinase Signalweg erreicht seine Effektivität in dendritischen und Mastzellen zum Teil durch die Veränderung von Ionenkanal-Aktivitäten. Also sind beide, einerseits Pi3K und andererseits Ionenkanäle wichtig für die Regulation von Funktionen dendritischer und Mastzellen. Trotzdem ist wenig bekannt über die Elemente stromabwärts von PI3K, die die Ionenkanäle in diesen Zellen regulieren. In dem gegenwärtigen Projekt war die Frage, ob zwei der Kinasen die PI3K nachgeschalten sind, phosphoinositid-dependent kinase 1 (PDK1) und mammalian target of rapamycin (mTOR) Ionenkanäle und davon abhängige Funktionen in dendritischen und Mastzellen regulieren. Wir haben gezeigt, dass die Behandlung dendritischer Zellen mit dem mTOR-Inhibitor Rapamycin zur Inhibierung von Strömen durch spannungsgesteuerte K+ - Kanäle, die in dendritischen Zellen zu den Familien Kv 1.3 und Kv 1.5 gehören, führt. Die Analyse der Zeitkonstanten der Aktivierung und Inaktivierung zeigte, dass Rapamycin eine schnellere Kv-Inaktivierung bewirkt hat. Um die Hypothese zu testen, dass Kv 1.3 und/oder Kv 1.5 durch mTOR reguliert werden können, wurde cRNA für Kv 1.3 oder Kv 1.5 gleichzeitig mit oder ohne cRNA für mTOR in Xenopus Oocyten injiziert. Die Kv 1.3 – und Kv 1.5 – Ströme wurden signifikant gesteigert durch die zusätzliche Expression von mTOR, ein Effekt, der durch Rapamycin aufgehoben werden konnte. Die Analyse der Aktivierungs- und Inaktivierungszeitkonstanten tau von Kv 1.3 und Kv 1.5 ergab, dass mTOR die Tau -Aktivierung und –Inaktivierung von Kv 1.3 aber nicht die von Kv 1.5 beeinflusste. Die Koexpression mit mTOR führte zu einer abgeschwächten Tau -Aktivierung und einer gesteigerten Tau -Inaktivierung, also zu einer schnelleren Aktivierung und langsameren Inaktivierung von Kv 1.3. Wie waren weiterhin daran interessiert, zu untersuchen, ob Rapamycin auch einen Effekt auf spannungsunabhängige K+ - Kanäle hat. Die Experimente dazu führten wir in Mastzellen aus dem Knochenmark von Mäusen aus (BMMCs), die bekannter weise die Ca2+- abhängigen K+ - Kanäle KCa3.1 exprimieren. Unsere Beobachtungen zeigten, dass Rapamycin, obwohl es die KCa3.1 – Kanal – Aktivierung nicht direkt beeinflusste, den Antigen-induzierten Anstieg des cytosolischen Ca2+- Spiegels der BMMCs verminderte, was sekundär zur Dämpfung der KCa3.1 – Kanäle führte. In den BMMCs untersuchten wir außerdem den Effekt einer anderen Kinase im PI3K-Signalweg, PDK1, auf Ionenkanäle und Zellfunktionen. Diese Arbeit bewies, dass die Stimulation des Antigen induzierten Ca2+- Einstroms, aber nicht die Ca2+- Ausschüttung aus intrazellulären Speichern in Mastzellen aus PDK1 hypomorphen Mäusen (pdk1hm) weniger stark ausgeprägt war als in Mastzellen aus den Wildtyp-Geschwistertieren (pdk1wt). Demnach schwächte der PDK1-Mangel den Ca2+- Einstrom ab und folglich auch indirekt die Ströme durch die Ca2+- aktivierten K+ - Kanäle KCa3.1. Das partielle PDK1-Defizit verhinderte nicht die Degranulation trotz des geringeren Ca2+- Einstroms in pdk1hm BMMCs. Beides, die ß;-Hexosaminidase- und die Histamin – Ausschüttung waren nicht signifikant unterschiedlich zwischen pdk1wt und pdk1hm BMMCs. Wir erstellten einen möglichen Mechanismus, der die unbeeinträchtigte Degranulation in pdk1hm BMMCs erklärt, indem wir zeigten, dass PDK1 zur Aktivierung zweier nachgeordneter Kinasen, SGK1 und PKCdelta; führte, wobei erstere die Degranluation in Mastzellen positiv und letztere negativ reguliert.