Identification of Aurora Kinase Substrates in Schizosaccharomyces pombe by Chemical Genetics and Quantitative Phosphoproteomics

Abstract

Aurora kinases are conserved throughout eukaryotes and are crucial for the proper execution of mitosis. The identification of Aurora substrates is important to elucidate the molecular function of the kinase. Based on the most obvious phenotypes of Aurora depletion or inhibition, several substrates had been identified through candidate-based approaches. However, Aurora kinases are known to contribute to processes for which the relevant substrates are unknown. In order to identify Aurora substrates on a proteome-wide scale, we applied site-specific quantitative phosphoproteomics in conjunction with chemical inhibition of an analogue-sensitive version of the fission yeast Aurora kinase Ark1 (Ark1-as3). Out of more than 8000 phosphorylation events that we detected, 70 phosphorylation sites (on 42 proteins) were probable targets of Aurora. Apart from a few known substrates, the majority of detected Aurora targets were previously unknown to be phosphorylated by Aurora. Given that several of these newly identified targets are implicated in diverse aspects of chromatin dynamics we propose that Aurora, apart from its role in controlling chromosome compaction and chromosome attachment to the mitotic spindle, has a more wide-spread function in modulating chromatin architecture during mitosis. To identify Aurora targets, we combined chemical inhibition and quantitative phosphoproteomics. Chemical inhibition often leads to unwanted side effects due to limited specificity of the small molecule inhibitor. To exclude such side effects from the analysis, we took a combined approach of genetic mutation and chemical inhibition that increases specificity and we controlled for side effects in the phosphoproteomics experiment. To further increase inhibitor specificity and erase possible side effects, we additionally developed covalent inhibitors for analogue-sensitive Aurora, which require two selectivity filters for binding and inhibition. We further engineered analogue-sensitive Aurora kinase to contain a binding site for such inhibitors and screened for the optimal electrophile in the chemical inhibitor. This enabled us to covalently inhibit Aurora and characterize the potential of the designed molecules as specific kinase inhibitors.

Aurora-Kinasen sind konserviert in Eukaryoten und sind entscheidend für die korrekte Abwicklung der Zellteilung. Die Identifikation von Aurora-Substraten ist wichtig, um die molekulare Funktion der Kinase zu verstehen. Basierend auf den offensichtlichsten Phänotypen einer Aurora-Depletion oder -hemmung wurden viele der Substrate in Kandidatenstudien identifiziert. Jedoch sind Aurora-Kinasen an Prozessen beteiligt für welche die relevanten Substrate nicht bekannt sind. Wir haben quantitative Phosphoproteomik in Verbindung mit der chemischen Hemmung einer analogsensitiven Variante der Aurora-Kinase Ark1 (Ark1-as3) aus der Spalthefe angewendet, um eine proteomweite Identifizierung von Aurora-Substraten zu erreichen. Von mehr als 8000 Phosphorylierungsereignissen waren 70 Phosporylierungsstellen (auf 42 Proteinen) mögliche Ziele der Aurora-Kinase. Abgesehen von ein paar wenigen bekannten Substraten war die Mehrzahl der entdeckten Aurora-Ziele nicht als solche bekannt. Aufgrund der Tatsache, dass viele der neu identifizierten Ziele in diversen Bereichen der Chromatindynamik beteiligt sind, schlagen wir vor, dass Aurora, abgesehen von ihrer Rolle in der Chromosomenkondensation und -anheftung an die mitotische Spindel, eine weitreichende Funktion bei der Bestimmung des Chromatinaufbaus während der Zellteilung hat. Wir haben chemische Hemmung und quantitative Phosphoproteomik kombiniert, um Aurora-Substrate zu identifizieren. Aufgrund der unzureichenden Spezifität von kleinmolekularen Hemmstoffen hat die chemische Hemmung oft unerwünschte Nebeneffekte zur Folge. Mit der Kombination einer genetischen Mutation und der chemischen Hemmung haben wir eine Erhöhung der Spezifität erzielt, und in unserem Phosphoproteomikexperiment eine Kontrolle hinzugefügt, um solche Nebeneffekte von der Analyse auszuschließen. Zusätzlich haben wir kovalente Hemmstoffe, welche zwei Selektivitätsfaktoren für die Bindung und Hemmung erfordern, für die analogsensitive Aurora-Kinase entwickelt, um die Hemmstoffspezifität weiter zu erhöhen und die unerwünschten Nebeneffekte zu beseitigen. Wir haben sowohl die analogsensitive Aurora-Kinase verändert, so dass sie eine Bindungsstelle für solch einen Hemmstoff besitzt, als auch eine Suche für ein optimales Elektrophil des chemischen Hemmstoffes durchgeführt. Dies ermöglichte es uns Aurora kovalent zu hemmen und das Potenzial der erzeugten Moleküle als spezifische Kinase-Hemmstoffe zu charakterisieren.