Charakterisierung der Interaktion von BAK1 mit BIP89, einer Pathogen responsiven Rezeptor ähnlichen Kinase mit leuzinreichen Wiederholungen aus Arabidopsis thaliana

Abstract

Sowohl in tierischen als auch in pflanzlichen Organismen werden deren Immunsysteme durch die Perzeption von konservierten molekularen Strukturen aus Pathogenen, den PAMPs, aktiviert. Beispielsweise wird das flg22-Peptid (Epitop aus dem bakteriellen Flagellin) in A. thaliana mit Hilfe der membranständigen Rezeptorkinase FLS2 erkannt. Nach der Aktivierung von FLS2 durch die Bindung von flg22 heteromerisiert diese mit der LRR-RLK BAK1. BAK1 wurde bereits als Corezeptor der LRR-RLK BRI1 in der Brassinolid abhängigen Pflanzenentwicklung gefunden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass BAK1 und eine andere, homologe LRR-RLK in der Zelltodkontrolle involviert sind. bak1-Insertionslinien zeigten dabei einen sich ausbreitenden Zelltod nach Infektion mit nekrotrophen Pilzen. In der vorliegenden Arbeit sollten weitere Signalkomponenten der Zelltodkontrolle nachgewiesen werden. Dazu wurde eine massenspektrometrische Analyse von BAK1-Interaktoren durchgeführt wobei die zwei LRR-RLKs BIP89 (BAK1 interacting protein 89) und BIL3 (BIP89 like 3) gefunden wurden. Beide zeigen eine Pathogen responsive Transkription, wobei BIL3 reprimiert wird und BIP89, analog zu BAK1, induziert wird. Die spezifische Interaktion zwischen BAK1 und BIP89 konnte mit Hilfe von Co-IP-Experimenten in Tabak bestätigt werden. Darüber hinaus wurde eine Interaktion der Kinasen im Hefedihybrid-Tropftest und im in vitro Kinaseassay festgestellt. Die Kinasen von BIP89, BIL1 und BIL3 zeigten keine Aktivität und wurden durch die BAK1-Kinase in den durchgeführten Experimenten phosphoryliert. Zur Untersuchung der Funktion der Interaktion zwischen BIP89 und BAK1 in der Zelltodkontrolle sollte der Einfluss der Phosphorylierung auf die Interaktion der Proteine analysiert werden. Dazu wurden BAK1-Kinasemutanten im Hefedihybrid-Tropftest, im Kinasetest und in Tabak verwendet. Dabei wurde eine Abhängigkeit der Interaktion zwischen den Kinasedomänen von BAK1 und BIP89 in der BAK1-Kinaseaktivität gefunden. Die Austausche in der Aminosäure T312A/D verursachten eine Schwächung der Interaktion im Tabak und im Hefedihybrid-System. In weiteren Experimenten wurden die in vitro Phosphorylierungsstellen von BIP89, BIL1 und BIL3 identifiziert, die durch BAK1 phosphoryliert werden. BIP89 zeigte Phosphorylierungen entlang der gesamten zytoplasmatischen Domäne. Zusätzlich konnten neue phosphorylierte Aminosäuren in BAK1 gefunden werden. Einige der identifizierten Phosphorylierungsstellen in BIP89 wurden mutagenisiert und auf das Interaktions- beziehungsweise Phosphorylierungsverhalten mit BAK1 hin überprüft. Die Austausche in der Aminosäure S330A/D in BIP89 (korrespondierend zu T312 in BAK1) führen zu einer Schwächung der Interaktion der Volllängenproteine zwischen BAK1 und BIP89 im Tabak. Darüber hinaus konnte keine Abhängigkeit der Phosphorylierung in BIP89 von der Interaktionsfähigkeit mit BAK1 festgestellt werden. Die Phosphorylierung verschiedener Aminosäuren von BAK1 und BIP89 scheint also deren Interaktion nur teilweise zu regulieren.

The immune system of animals and of plants is activated upon the perception of conserved pathogen associated molecular patterns (PAMPs). One example of a classical PAMP is the Flagellin peptide flg22, which is recognized by the receptor like kinase FLS2 in Arabidopsis thaliana. The binding of flg22 leads to the activation of FLS2, which then heterodimerizes with BAK1, another LRR-RLK. BAK1 was first identified as a co-receptor of BRI1 to regulate the Brassinolide dependent pathway involved in plant developmental processes. More recently BAK1 and its closest homolog were shown to be also involved in cell death control. The cell death phenotype could be observed in bak1-null mutants which showed an accelerated cell death after infection with necrotrophic fungi. One aim of the presented work was to identify more BAK1 interacting proteins involved in cell death control. A first approach was a liquid tandem mass spectrometry analysis of co-purified BAK1-interaction partner in the cell death control pathway in A. thaliana. Throughout this approach two further LRR-RLKs, BIP89 (BAK1 interacting protein 89) and BIL3 (BIP89 like 3), were found. Both genes showed a pathogen responsive expression, whereupon BIL3 was downregulated and BIP89, like BAK1, was induced after pathogen challenge. The identified interaction between BAK1 and BIP89 was verified by Co-immunoprecipitation experiments in transgenic tobacco. Moreover the kinases also interacted in the Yeast two hybrid droplet assays and in the in vitro kinase assays. The kinases of BIP89, BIL1 and BIL3 didn’t show any activity their selves, but were phosphorylated by the BAK1 kinase domain. To discover the role of the interaction between BAK1 and BIP89 in the cell death control, the influence of the phosphorylation was analyzed. Therefore the BAK1-kinase mutants were tested in the Y2H system, in in vitro kinase assays and in tobacco Co-IPs. It was shown that the interaction was dependent on the BAK1 activity. Furthermore there was an impairment of interaction between BAK1 and BIP89 in tobacco and Y2H experiments upon mutation in the amino acid residue T312 in BAK1.In following experiments the in vitro phosphorylation sites of BIP89, BIL1 and BIL3 phosphorylated by BAK1, were identified. BIP89 showed a phosphorylation along the whole cytoplasmatic domain. Additionally new phosphorylated amino acids in BAK1 were found. Some of the identified sites of BIP89 were mutated and their influence on the interaction and phosphorylation behavior was analyzed. The exchanges in the aminoacid S330A/D in BIP89 (corresponding to residue T312 in BAK1) lead to a weakening of the interaction between the full length proteins of BAK1 and BIP89. Moreover the interaction between BIP89 and BAK1 was not dependent on the phosphorylation of BIP89. So the phosphorylation on different amino acids in BAK1- and BIP89- kinase seems only to play a partially role in regulating their interaction.