Characterisation and Behavioural Consequences of alpha Synucleinopathy in Transgenic Mice

Abstract

Parkinson's disease (PD) is a chronic progressive neurodegenerative disorder, which is characterized by the degeneration of dopaminergic neurons. The neuronal protein alpha-Synuclein (aSyn), which is enriched in synaptic terminals and regulates synaptic vesicle activity, is linked to PD. The three known point mutations leading to an amino acid exchange in aSyn, A30P, A53T and E46K as well as duplications or triplications of the aSyn coding gene are linked with autosomal dominant PD and dementia with Lewy bodies (DLB). In PD and DLB aSyn forms fibrils, which are the major component of Lewy bodies (LB), Lewy neurites (LN) and of glial cytoplasmic inclusions in multiple system atrophy (MSA). The cellular mechanisms regulating neuronal dysfunction during these diseases are intensively examined in vitro and in diverse animal models. Together with MSA, where aSyn accumulates in glial cells, the aSyn related neuronal disorders DLB and PD are together referred as a-Synucleinopathies. In this work an [A30P]aSyn overexpressing mouse model was used to perform brain region specific characterisation of a-Synucleinopathy in the brainstem (BS), midbrain (MB), cortex (Cx), olfactorial bulb (OB), hippocampus (Hip) and the amygdala, all regions which were shown to overexpress the aSyn transgene. Especially the amygdala, the key region of the emotional learning circuitry, which is affected in demented patients, was closer investigated for the effect of a-Synucleinopathy on neuronal function. Histological investigation of brains of aged transgenic animals showed age- dependent accumulation of neuropathological aSyn phosphorylated at the Ser129 residue (pSer129 aSyn) mostly in LB and LN like structures in the BS and MB. This staining pattern was colocalised with Thioflavine-S (ThS) positive amyloidosis as well as with Gallyas silver staining showing neuropathology. The glomerular region of the OB displayed similar age- dependant pathology although genuine LB/LN like pSer129 aSyn positive structures could not be observed in the OB. PSer129 aSyn was detected also throughout the Cx in the cytoplasm as well as in a nuclear staining pattern of young and old transgenic mice, likewise in hippocampal cornus amonis 1 (CA1), CA3 and subicular region. In contrast, none of these brain regions were positive for amyloidosis or silver staining positive neuropathology. Interestingly proteinbiochemical investigation revealed an aSyn form only present in the insoluble fraction of cortical lysates. Another striking observation was the age-dependent accumulation of transgenic non- phosphorylated aSyn in the synaptic regions of CA1 and CA3, which are known to be important for neuronal plasticity. Concomitantly old transgenic mice displayed reduced context learning. The emotional learning circuit of the basolateral amygdala (BLA) was found to be highly positive in cells displaying nuclear pSer129 aSyn staining, which was prominent in aged mice. Furthermore only aged transgenic mice displayed pSer129 aSyn positive, LN-like staining pattern most prominent in the medial part of the central nucleus (CeM). Both regions, the BLA as well as the CeM are known to be involved in long term potentiation (LTP) and again, old transgenic mice performed worst in the fear conditioning (FC) related emotional learning test. The poor performance of old transgenic mice coincided with reduced levels of the immediate early gene c-FOS measured in the BLA and CeM of the same animals directly after FC. Moreover levels of a Ser129 phosphotransferase Polo-Like-Kinase-2 (PLK2), which has been shown to be involved in neuronal plasticity in the hippocampus, were not upregulated after FC in old transgenic animals. Only young transgenic and old wild type animals displayed PLK2 upregulation in the BLA and in the CeM after FC. As for the pathologic pSer129 aSyn, cell culture experiments with human embryonic kidney (HEK293E) cells transfected with aSyn and its candidate kinase G-protein-reseptor-kinase-5 (GRK5) reproduced the nuclear pSer129 aSyn-staining pattern observed in transgenic mice. More importantly, in the transgenic mice pSer129 aSyn positive stainings were observed to colocalise in the neuropil with PLK3 and in the cytoplasm and in nuclear regions with PLK2, pointing to PLK2 and PLK3 as relevant kinases for the phosphorylation of the Ser129 residue of aSyn in a-Synucleinopathies. Taken together, this work could show the different qualities of a-Synucleinopathy in all brainregions overexpressing aSyn in transgenic (Thy1)h[A30P]aSyn mice. Furthermore a direct correlation between a-Synucleinopathy and a lower neuronal activation could be demonstrated in the emotional learning circuitry.

Die Parkinson’sche Erkrankung (PD: Parkinson's disease) ist eine chronisch fortschreitende Erkrankung, welche durch die Degeneration von dopaminergen Neuronen charakterisiert ist. Das neuronale Protein alpha-Synuklein (aSyn), welches in synaptischen Enden angereichert ist und die synaptische Vesikel-Aktivitaet reguliert, wird mit PD in Verbindung gebracht. Die drei Punktmutationen A30P, A53T and E46K, sowie eine Erhoehung der aSyn Proteinkonzentration durch Gen-Duplikation oder -Triplikation, werden mit autosomal dominantem PD und Lewy Body Demenz (DLB) in Verbindung gebracht. Sowohl in PD, als auch in DLB bildet aSyn Fibrillen, die den Hauptbestandteil von Lewy Bodies (LB), Lewy Neuriten (LN) und cytoplasmatischen Einschlüssen in Gliazellen in der multiplen System Atrophy (MSA) ausmachen. Die zellulären Mechanismen, die zu neuronalen Dysfunktionen bei diesen Erkrankungen fuehren, werden in vitro und in dieversen Tiermodellen intensiv untersucht. Dadurch wird ein besseres Verständnis der bei diesen Erkrankungen ablaufenden zellbiologischen Vorgänge erzielt. Zusammen mit MSA, bei der aSyn in Gliazellen akkumuliert, werden die aSyn verwandten neuronalen Erkrankungen DLB und PD als Alpha-Synukleinopathien zusammengefasst. In dieser Arbeit wurde ein [A30P]aSyn überexprimierendes Mausmodell verwendet, um eine Gehirnregion-spezifische Charakterisierung von a-Synukleinopathie im Hirnstamm (HS), dem Mittelhirn (MH), dem Cortex (Cx), dem Bulbus Ofactorius (BO), dem Hippocampus (Hip) und der Amygdala durchzuführen; Regionen in denen bereits die Überexpression des [A30P]aSyn Transgens nachgewiesen worden ist. Besonders in der Amygdala, der zentralen Region des emotionalen Lernens, welche auch in dementen Patienten betroffen ist, wurden die Konsequenzen einer vorhandenen a-Synukleinopathie auf die neuronale Funktionalitaet nach Aktivierung durch Angstkonditionierung detailliert untersucht. Histologische Untersuchungen von Gehirnen gealterter transgener Tiere zeigten eine altersabhaengige Akkumulation von neuropathologischem, am Ser129 phosphorylierten aSyn (pSer129 aSyn). Dieses war hauptsaechlich in LB und LN ähnlichen Strukturen im HS und MH auffindbar und korrelierte mit Thioflavine-S (ThS) positiver Amyloidose und neuropathologischer Gallyas Silberfaerbung. Die glomeruläre Region des BO zeigte eine aehnliche altersabhaengige Pathologie, obwohl LB/LN aehnliche pSer129 aSyn positive Strukturen im BO nicht beobachtet werden konnten. pSer129 aSyn wurde außerdem im Zytoplasma des Cx und auch in Nuclei des Hippocampus CA1, CA3 (CA: hippocampaler Cornus Amonis) und in der subicularen Region von jungen und alten transgenen Mäusen detektiert. Im Gegensatz dazu war keine dieser Gehirnregionen positiv für Amyloidose oder eine durch Silberfärbung nachweisbaren Neuropathologie. Interessanterweise zeigten proteinbiochemische Analysen eine aSyn Form, die nur in der unloeslichen Fraktion von kortikalen Lysaten zu finden war. Eine weitere Beobachtung war die altersabhängige Akkumulation von transgenem nicht- phosphoryliertem aSyn in synaptischen Regionen des CA1 und CA3, in welchen Langzeit-Potenzierung (LTP) statt findet. Damit einhergehend zeigten alte transgene Tiere ein vermindertes Kontext-Lernvermoegen. In der basolateralen Amygdala (BLA) wurde vor allem in alten transgenen Mäusen nukleäres pSer129 aSyn detektiert. Außerdem wurden nur in alten transgenen Maeusen im amygdaloiden medialen Centralen Nucleus (CeM) LN- artige pSer129 aSyn positive Strukturen detektiert. Beide Regionen der Amygdala, sowohl die BLA als auch der CeM, sind Bereiche in denen LTP stattfindet. Korrelierend mit dieser Pathologie bestätigte sich das beeinträchtigte emotionale Lernen alter transgener Tiere. Diese Beeinträchtigung korrelierte außerdem mit einem reduzierten Level des immediate early Gens c-FOS in der BLA und dem CeM der Tiere direkt nach Angstkonditionierung (AK). Auch die Ser129 aSyn Phosphotransferase Polo- Kinase-2 (PLK2), welche die neuronale Plastizität im Hippocampus beeinflußt, wurde in alten transgenen Tieren nicht durch AK hochreguliert. Nur junge transgene und alte Wildtyp-Tiere zeigten eine PLK2 Hochregulation in der BLA und in dem CeM nach der AK. Noch wichtiger aber ist, dass die pSer129 aSyn postitive Faerbung in den transgenen Mäusen im Neutropil mit PLK3, im Zytoplasma und in den nukleären Regionen mit PLK2 kolokalisiert, was darauf hindeutet, dass PLK2 und PLK3 wichtige Kinasen representieren, die aSyn am Ser129 phosphorylieren und demnach bei der Entstehung von a-Synukleinopathien eine wichtige Rolle spielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit unterschiedliche Qualitäten von a-Synukleinopathie in verschiedenen Gehirnregionen von transgenen (Thy1)h[A30P]aSyn Maeusen, die aSyn ueberexprimieren. Des weiteren konnte nach emotionalen Lerntests eine direkte Korrelation zwischen a-Synukleinopathie und einer verminderten neuronalen Aktivierung in der Amygdala gezeigt werden.