High-Resolution Near-Field Optical Microscopy of Biological Molecules on Gold Surfaces

Abstract

Scanning near-field optical microscopy (SNOM) and tip-enhanced Raman scattering (TERS) as general methods have passed the proof-of-principle stage. However, state-of-the-art SNOM and TERS are still done on custom-built setups; therefore, each design has to go through this phase individually. In this work, I have affirmed the possibilities of our SNOM setup to investigate biological molecules. Valuable results for adenine, DNA and amyloid fibrils have been presented.

Our setup operates at room temperature and in air. It can investigate non-transparent samples. Its special features include a parabolic mirror as the element both for focusing the laser light and for collecting the scattered signal from the sample. Its high collection angle of almost 180 Degrees stretching above the sample allows to collect as much of the scattered signal as possible. We employ higher order laser modes to achieve a highly confined focus for confocal optical scans and to be able to switch between a focal polarisation in sample plane (x, y) or perpendicular to it (z). More importantly even, the strong z-polarisation is used to efficiently excite a gold tip. This tip thus acts as a topographical probe and a plasmonically excited optical antenna in one. In its second function, it allows us to collect TERS spectra.

Our parabolic mirror based scanning near-field optical microscope proved to be a good and flexible setup for various approaches to biological molecules. In this work, I investigated three sets of samples: gold Fischer patterns, DNA double strands and amyloid fibrils.

Plasmonics of Gold Fischer Patterns:

As a means to obtain a controllable and thus systematically improvable substrate for SERS measurements, I investigated gold Fischer patterns: regular arrays of nano-triangles. I performed confocal scans in both radial and azimuthal laser mode on triangles of different height and edge length on two different materials, namely silicon and glass.

I was able to map the far-field radiation of near-field ‘hot spots’ of such Fischer patterns. The luminescence patterns I recorded in this way differed greatly on silicon and glass. In general, I obtained stronger luminescence and a higher contrast on glass. The patterns also varied with the height and the edge length of the triangles.

I compared my measurements to a simple convolution calculation of the respective focal intensity and the respective triangle sizes. This allowed for the distinction between the samples on which particle plasmons were most probably excited and those samples where the assumption of a superficial light scattering might suffice to explain the observed patterns.

SERS spectra of the DNA base adenine were obtained on the two smallest investigated gold triangles on glass.

Investigations of DNA Strands:

I investigated the DNA base adenine and natural calf-thymus DNA double strands by SERS and detected very low concentrations of the molecules. I topographically imaged individual DNA double strands immobilized on crystalline gold surfaces and collected TERS spectra. The Raman enhancement factor was at least in the order of 10^3 or 10^4. Many of the Raman bands found by SERS and TERS matched literature values.

Near-Field Investigations of Amyloid Fibrils:

Investigating amyloid fibrils on a flat gold surface, I could image insulin amyloid and hen egg white lysozyme amyloid topographically. I obtained TERS spectra of insulin amyloid with a Raman enhancement factor in the order of again 10^3 minimum.

Die aperturlose optische Rasternahfeldmikroskopie (SNOM) ist eine Entwicklung der letzten zwei Jahrzehnte. Sie ist eine Kombination aus Rastersondenmikroskopie, die ein topografisches Höhenprofil der Oberfläche liefert, und optischer Methoden. Dafür wird die Rasterspitze gleichzeitig als optische Antenne eingesetzt. Das Nahfeld am Spitzenende liefert dann simultan ein Lumineszenz-Bild. Dessen laterale Auflösung ist unabhängig von der Lichtwellenlänge und nur durch die Größe des Spitzenendes bestimmt; so kann die klassische optische Auflösungsgrenze umgangen werden.

In unserem Fall dient eine feine Goldspitze als Rastersonde und optische Antenne in einem. Sie wird in den Fokus eines Parabolspiegels gebracht, der wiederum von einem radialen Lasermodus höherer Ordnung bestrahlt wird. Das sorgt im Fokus für eine starke Lichtpolarisation entlang der Spitzenachse. Dadurch werden die Elektronen im Leitungsband des Goldes zu Schwingungen angeregt: im resonanten Fall spricht man von Plasmonen-Resonanzen. Diese Plasmonen wiederum sorgen für ein intensives und stark lokalisiertes elektromagnetisches Nahfeld in dem feinen Spalt zwischen Spitzenende und Probe.

Dank dieses verstärkten Nahfeldes können wir zudem spitzenverstärkte Raman-Spektren (TERS) aufnehmen. Die inelastische Raman-Streuung an Molekülen erlaubt dabei eine spezifische Zuordnung der angeregten Molekülschwingungen und damit der vorliegenden Moleküle. Unser SNOM-Mikroskop arbeitet bei möglichst natürlichen Bedingungen, d.h.\ an Luft und bei Raumtemperatur. Durch die Beleuchtung von oben können auch undurchsichtige Proben vermessen werden.

In dieser Arbeit habe ich die Probenuntersuchung mittels SNOM in unserem Labor auf biologische Moleküle ausgeweitet.

Zunächst untersuchte ich in konfokalem Modus, ohne den Einsatz einer Spitze, regelmäßige Anordnungen von Gold-Nanodreiecken. Diese sogenannten Fischer-Muster sollten später als Substrate für oberflächenverstärkte Raman-Spektren (SERS) dienen. Zu diesem Zweck prüfte ich systematisch ihre plasmonischen Eigenschaften. Ich studierte unterschiedliche Fischer-Muster eingehend mit den beiden Laser-Modi, die uns in unserem Messaufbau zur Verfügung stehen: einem radialen und einem azimutalen Modus. Ersterer sorgt für eine starke vertikale, zweiterer für eine ausschließlich horizontale Lichtpolarisation im Fokus. So konnte ich gezielt unterschiedliche Plasmonen-Modi in den Dreiecks-Anordnungen anregen. Ich untersuchte und verglich auf diese Art Fischer-Muster aus Dreiecken unterschiedlicher Kantenlänge und Höhe auf zwei verschiedenen Materialien, nämlich Silizium und Glas. Dies sollte mich zu einem idealen Substrat für SERS-Messungen führen. Auf den kleinsten der untersuchten Dreiecke auf Glas erhielt ich schließlich stark verstärkte Raman-Spektren von wenigen Molekülen der DNA-Base Adenin. Die dabei gemessenen Spektrallinien konnte ich Literaturwerten zuordnen.

Die Desoxyribonukleinsäure (DNA) ist wohl das bekannteste Biomolekül. So war ein naheliegendes Ziel dieser Arbeit, einzelne DNA Stränge auf einem flachen Goldsubstrat zu fixieren und per SNOM zu untersuchen. Die Plasmonen, die in der Goldspitze angeregt werden, sorgen für Spiegelladungen in der Goldoberfläche. Dadurch wiederum wird in der schmalen Lücke zwischen Spitze und Probe ein besonders intensives Nahfeld erzeugt. Sowohl auf einem Gold-Einkristall als auch auf kommerziellen kristallinen Gold-Oberflächen gelang die topografische Abbildung und die Aufnahme von TERS Spektren. Der TERS Verstärkungsfaktor lag dabei in einer Größenordnung von mindestens 10^3 bis 10^4. Als Referenz nahm ich außerdem SERS-Spektren an rauen Kanten aufgedampften Goldes und zusätzlichen Gold-Nanopartikeln auf. Sowohl die SERS- als auch die TERS-Spektrallinien von DNA konnte ich erfolgreich mit Werten aus bisherigen Veröffentlichungen abgleichen.

Als drittes Teil-Projekt dieser Arbeit untersuchte ich - wieder auf glatten Gold-Oberflächen - sogenannte Amyloid-Fibrillen. Diese abnormen Anreicherungen von Proteinen zu langen geordneten Strängen sind Indikatoren für etliche Krankheiten, unter anderem findet man sie bei Alzheimer- und Parkinson-Patienten. Wie zuvor bei der DNA erhielt ich sowohl topografische Aufnahmen als auch spitzenverstärkte Spektren. Wieder lag der gemessene Verstärkungsfaktor der TERS-Spektren bei mindestens 10^3. Auch bei den Amyloid Fibrillen gelang eine Zuordnung der beobachteten Raman-Banden zu Werten aus der Literatur.

Diese Ergebnisse belegen, dass unser selbsterstellter SNOM-Messaufbau sehr gut für die Untersuchung von Biomolekülen geeignet ist. Die im Laufe dieser Doktorarbeit gewonnenen Erkenntnisse zeigen das Potential dieser Methode und bereiten die Basis für weitergehende SNOM- und TERS-Messungen an biologischen Molekülen.