Photoaffinity Based Immobilization and Target Fishing of Atorvastatin Lactone and Synthesis of the C1-C13 Fragment of Biselyngbyaside

Abstract

We describe a novel strategy to the atorvastatin lactone based on a Paal-Knorr synthesis of pyrrole by condensation of a 1,4-diketone with a functionalized amine side chain. The amine contains the syn-1,3-diol subunit and a benzyl ether function at the other end of the chain. The C4 position of pyrrole allowed for manipulations via iodination, Li-X exchange and carboxylation. The 4-H acid pyrrole could be converted to the final atorvastatin lactone via amide formation, debenzylation, oxidation and lactonization in the final steps. The key building block, 2-((4R,6S)-6-(2-(benzyloxy)ethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-4-yl)ethanamine was obtained by two sequential asymmetric transfer hydrogenative carbonyl allylation steps according to Krische et al. In order to obtain atorvastatin lactone derivatives connected to a linker, the pyrrole-4-carboxylic acid was condensed with a triethylene glycol having an aniline terminus to give the corresponding amide. After immobilization on beads classical affinity chromatography was carried out. As an alternative to the cumbersome classical affinity chromatography we describe the combination of the Osada strategy of carbene based immobilization of small molecules on affinity resins and the mass spectrometry based stable isotope labeling of amino acids in cell culture (SILAC) method for affinity based fishing and identification of the biological targets. To prove this concept we successfully used a classical example with fishing of cyclophilin as a known biological target of cyclosporin A. This strategy was further applied for the fishing of biological off-targets of atorvastatin lactone and the unknown targets of new anti-tumor molecule englerin A. Therefore, we prepared diazirine based triethylene glycol linker with a carboxyl terminus which was immobilized on Toyopearl AF 650 amino beads and the small molecule was loaded on the prepared beads using the Osada method by irradiating the small molecules (englerin A and atorvastatin lactone) under the UV light (365 nm, 4 J cm−2, 8 watts). The fishing of the drug targets was done (by project colleague Yvonne Etzel) from the cell lysate of HEK293T cell lines (kidney cells). The experiments were carried out using bead control as well as soluble competitor. The analysis of the fished proteins was done by the SILAC technique. The initial experiments indeed revealed some potential protein targets. This combined pathway could be useful for the identification of unknown biological targets of various small molecules. With a view towards the total synthesis of a natural product, we developed a concise route to a key fragment of biselyngbyaside. This new macrolactone, isolated from a marine cyanobacterium Lyngbya sp. was collected in the Okinawa prefecture. It displayed cytotoxicity against HeLa S3 cells with an IC50 of 0.1 mg mL–1. Also, the average growth inhibition (GI) was 0.6 mM in a panel of 39 cell lines. An advanced intermediate fragment C1–C13 of a biselyngbyaside containing vinyl iodode at one of the termini was prepared by a cross metathesis reaction between a vinyl alcohol and homoallyl building blocks. The allyl alcohol fragment was prepared by Amano PS lipase mediated hydrolytic kinetic resolution of racemic 3-hydroxy-4-pentenoate followed by further modification. The latter fragment, containing two stereocenters, was obtained by employing an asymmetric alkylation, a Wittig reaction, a hydrozirconation, and a Brown allylation as key steps.

Wir beschreiben eine neue Strategie zum Atorvastatin-Lacton mit einer Paal-Knorr Pyrrolsynthese über die Kondensation eines 1,4-Diketons mit einem Amin, welches bereits einen Großteil der Seitenkette aufweist. Das Amin beinhaltet eine syn-1,3-Diol Untereinheit und eine Benzylether-Funktion am Ende der Kette. Die C4-Position am Pyrrol erlaubt Funktionalisierungen über Iodierung, Li-X Austausch und Carboxylierung. Die 4-H Pyrrolsäure konnte schließlich über Amid-Bildung, Debenzylierung Oxidation und im letzten Schritt Lactonisierung in das Atorvastatin-Lacton überführt werden. Das Hauptfragment 2-((4R,6S)-6-(2-(Benzyloxy)ethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-4-yl)ethanamin wurde über zwei sequentielle asymmetrische Transfer-Hydrier-Carbonyl-Allylierungs-Schritte nach Krische et al. erhalten. Um mit einem Linker verbundene Atorvastatin-Derivate zu erhalten, wurde die Pyrrol-4-Carbonsäure mir einem Triethylenglykol mit Anillin-Terminus kondensiert, um das entsprechende Amid zu erhalten. Nach Immobilisierung auf Toyopearl-Beads wurde klassische Affinitätschromatographie durchgeführt. Als Alternative zur mühsamen Affinitätschromatographie beschreiben wir die Kombination der Osada-Strategie der Carben-basierten Immobilisierung kleiner Moleküle auf Affinitäts-Harzen und der Massenspektrometrie-basierten Markierung von Aminosäuren mit stabilen Isotopen in Zellkulturen (SILAC) für affinitätsbasierte Suche und Identifikation der biologischen Targets. Um dieses Konzept zu beweisen, verwendeten wir erfolgreich ein klassisches Beispiel, in dem wir Cyclophilin als bekanntes biologisches Target von Cyclosporin A identifzieren konnten. Des Weiteren wurde diese Strategie verwendet um biologische Off-Targets des Atovastatin Lactons und unbekannte Targets von Englerin A zu finden. Hierzu synthetisierten wir einen Diazirin-basierten Triethylenglycol-Linker mit Carboxyl-Terminus, der auf Toyopearl AF 650 Amino Beads immobilisiert wurde. Die so hergestellten Beads wurden unter Verwendung der Osada-Methode mit den kleinen Molekülen beladen, in dem man die kleinen Moleküle bestrahlte (Englerin A beziehungsweise Atorvastatin Lacton unter UV-Licht, 365 nm, 4 J·cm–2, 8 W). Das Fischen der Arzneimittel Targets wurde (von der Projektkollegin Yvonne Etzel) mit Zelllysat von HEK293T Zelllinien (Nierenzellen) durchgeführt. Die Experimente wurden sowohl mit Bead Kontrolle als auch mit löslichem Kompetitor durchgeführt. Die Analyse der gefischten Proteine wurde mit der SILAC-Technik durchgeführt. Erste Experimente ließen in der Tat einige potentielle Protein-Targets erkennen. Dieser kombinierte Weg könnte hilfreich für die Identifizierung von unbekannten biologischen Targets von unterschiedlichen kleinen Molekülen sein. Hinblick auf die Totalsynthese eines Naturstoffes entwickelten wir eine kurze Syntheseroute zu einem Schlüsselfragment von Biselyngbyasid. Dieses neue Makrolacton wurde aus einem marinen Cyanobakterium Lyngbya sp. aus der Präfektur Okinawa isoliert. Es zeigt Zytotoxizität gegenüber HeLa S3 Zellen mit einem IC50 von 0.1 mg·mL–1. Die mittlere Wachstumshemmung (GI) lag bei 0.6 mM in einer Auswahl aus 39 Zelllinien. Ein anspruchsvolles Zwischenfragment C1–C13 von Biselingbyaside mit Vinyliodid an einem Ende wurde über eine Kreuzmetathesereaktion zwischen einem Vinylalkohol und Homoallylbausteinen hergestellt. Das Allylalkoholfragment wurde über eine Amano PS Lipase unterstützte hydrolytische kinetische Resolution von racemischer 3-Hydroxy-4-pentencarbonsäure synthetisiert, gefolgt von weiteren Modifizierungen. Das letzte Fragment, das zwei Stereozentren enthält, wurde unter Verwendung einer asymmetrischen Alkylierung, einer Wittig-Reaktion, einer Hydrozirconierung und einer Brown-Allylierung als Schlüsselschritte erhalten.