Untersuchung der Effektormechanismen von Natürlichen Killerzellen gegenüber Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten

Abstract

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind wichtige Effektorzellen der angeborenen Immunantwort, die entscheidend sind für die initiale Reaktion auf Plasmodium falciparum-Infektion sowie die Regulation nachfolgender adaptiver Prozesse. In der vorliegenden Arbeit sollte ihr Einfluss auf P. falciparum infizierte Erythrozyten (iRBZ) in vitro untersucht werden. Insbesondere sollten Mechanismen der direkten Aktivierung von NK-Zellen und deren Einflussnahme auf die Parasitenentwicklung durch Ausübung von Effektorfunktionen analysiert werden. Zunächst wurde ermittelt, inwiefern die NK92-Zelllinie als Modell bei der untersuchten Interaktion geeignet ist. Die Transkriptionsanalyse von NK92-Zellen zeigte, dass die Mehrheit der regulierten Gene nach 24h Kokultur mit iRBZ im Zusammenhang mit Zellzyklusprogression, Antiapoptose und Zellwachstum stand. Weiterhin waren einige Gene aktiviert, die Immunantwort und Aktivierung der NK-Zellen regulieren. Allerdings sollten diese Ergebnisse unter dem Aspekt der offensichtlichen Voraktivierung der verwendeten Zelllinie betrachtet werden, die sich als konstitutive Expression von Aktivierungsmarkern und Interferon-gamma-Produktion äußerte. Obwohl die NK92-Zellen einen wachstumshemmenden Einfluss auf P. falciparum auszuüben schienen, war dieser nicht spezifisch und die Zelllinie erwies sich unter den beobachteten Bedingungen als ungeeignetes Modellsystem. Nachfolgende Analyse von Rezeptoren der IL-6 Familie machte deutlich, dass diese durch unterschiedliche Zytokine (IFN-alpha, IL-6 und IL-2/-12/-18), aber nicht die parasitierten Erythrozyten beeinflusst werden konnten. IL-6 scheint in einem negativen Feedback-Loop die Beendigung der Signalkette durch verminderte Expression der untersuchten Rezeptoren zu bewirken, während die anderen Zytokine in unterschiedlichem Maße eine verstärkte Rezeptorexpression induzierten. Weitere Untersuchungen von Rezeptoren und Liganden ergaben einerseits keinen Einfluss auf den aktivierenden Rezeptor NKG2C und andererseits auf MICA/B sowie HLA-E. Jedoch könnte der Korezeptor CD94 von sowohl aktivierenden als auch inhibierenden NKG2-Rezeptoren bei der Bindung von Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) auf der Erythrozytenmembran eine Rolle spielen, da er immer auf der NK-Zelloberfläche exprimiert war. Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen wurde eine Hypothese zur Erkennung und Eliminierung der iRBZ erstellt. Diese beinhaltet, dass NK-Zellen über Hsp70 auf der iRBZ-Membran zur erhöhten Granzym B-Freisetzung stimuliert werden, was in der Eryptose der parasitierten Erythrozyten resultiert. In der vorliegenden Arbeit konnte diese Hypothese bestätigt werden. Des Weiteren konnte der Effekt durch das Hsp70-Epitop TKD-Peptid verstärkt werden. Es ist daher denkbar, TKD oder Hsp70 selbst als Immunostimulans oder als Adjuvans in der Impfstoffentwicklung zu nutzen, wodurch sich neue Alternativen für die Prävention oder Behandlung von Malaria eröffnen.

Natural Killer (NK) cells are important effector cells of the innate immune system and are thought to play a crucial role in early responses to Plasmodium falciparum-infection and by regulating adaptive immunity. The aim of this thesis was to investigate the interaction between NK cells and P. falciparum-infected erythrocytes in vitro. Particular interest was on elucidation of mechanisms occurring during such interaction and to rule out whether the intracellular parasite has a direct impact on activation of NK cell effector functions. First, assessment of suitability of the NK92 cell line as a model to study NK cell-iRBC-interaction was addressed. Transcription analysis of NK92 cells showed that the majority of regulated genes after 24h co-culture were linked to cell cycle progression, anti-apoptosis and cell growth. Additionally, genes important for regulation of immune responses and NK cell activation were altered. However, those results have to be interpreted in the context of obvious pre-activation of the used cell line. Although NK92 seemed to exert a growth-limiting influence on P. falciparum, this effect was not specific. Given these circumstances, NK92 cells cannot be considered as a good model to study NK cell-parasite-interactions in malaria in vitro. Subsequent analysis of IL-6-family receptors revealed a differential regulation by several cytokines (IFN-alpha, IL-6 und IL-2/-12/-18-mix), but not the parasitized erythrocytes themselves. IL-6 seemed to stop signal transduction via a negative feed-back loop, while the other cytokines resulted in increased receptor expression. Further investigation of receptors and ligands demonstrated no involvement of the activating receptor NKG2C or ligands like MICA/B and HLA-E. However, CD94 could serve as a co-receptor of erythrocyte membrane-associated heat shock protein (Hsp) 70, since it was constitutively expressed on the NK cell surface. Due to Hsp70 on iRBC, NK cells were stimulated to elevated granzyme B release leading to subsequent eryptosis of the parasitized erythrocytes. This proposed mechanism is promising since the recognised Hsp70 epitope TKD-peptide could serve as an immunostimulants or Hsp70 itself as an adjuvants in vaccine development which could open the way for new alternatives of malaria prevention or treatment.