The role of Kinesin-3 in regulating synaptic development in Drosophila

Abstract

Synaptic development is a very complex and dynamic process. So far, mechanisms regulating synaptic development are still not well understood.

In this study, the Drosophila neuromuscular junction is used as a model to investigate mechanisms regulating synaptic development. An unbiased forward genetic screening indentified unc-104bris, which is a missense mutation of a conserved residual (R561H) in the forkhead associated (FHA) domain of the Drosophila kinesin-3 homolog unc-104. unc-104bris mutant larvae are characterized by the distinct synaptic assembly phenotype that about 30% of the glutamatergic synapses at the neuromuscular junction (NMJ) are devoid of the presynaptic active zone (AZ) protein Bruchpilot (Brp), whereas in wildtype larvae less than 5% of the synapses which are nascent lack presynaptic Brp. What is more, unc-104bris mutant NMJs have much smaller synaptic boutons, and the subsynaptic reticulum (SSR), an elaborate membranous structure formed by the muscle membrane which surrounds the NMJ, is not well developed. unc-104bris mutant larvae die at late 3rd instar stage/early pupal stage and suffer from severe locomotion impairments. The objective of this study is to systemically characterize the synaptic assembly phenotype and to identify the mechanisms underlining the impaired synaptic development in unc-104bris mutants.

In the first set of experiments, I find that the level of total Brp at unc-104bris mutant NMJs drops to half of that in wildtype. Excessive Brp deposit is found at the cell body region of the ventral nerve cord (VNC) in unc-104bris mutant larvae. However, the decreased Brp puncta formation at presynaptic active zone cannot be totally explained by decreased Brp level. Furthermore, other major active zone components suggesting that AZ assembly is abolished in these synapses. Localization of synaptic vesicle (SV), SV associated proteins and peptide filled dense core vesicles (DCV) are severely reduced at unc-104bris mutant NMJs as a result of reduced kinesin-3 function. Synaptic activity is also impaired at unc-104bris mutant NMJs, which can be rescued by presynaptic reexpression of unc-104 cDNA. Postsynapticly, recuitment of the inotropic glumate receptor subunit GluRIIA, but not GluRIIB is selectively reduced at unc-104bris mutant NMJs, implying that a transsynaptic signaling regulating receptor clustering is perturbed by mutation in this neuronal kinesin.

In the second set of experiments, the mechanism underlying the synaptic development phenotype in unc-104bris mutant is investigated. unc-104bris mutant NMJs have much smaller synaptic bouton, which is accompanied by doubled overall NMJ length. This closely resembles the NMJ overgrowth phenotype in larvae which have enhanced dual-leucine zipper kinase (DLK, the Drosophila homolog of which is Wallenda (Wnd)) activity. Indeed, downregulating the Wnd MAPK pathway by loss of function mutation in wnd, or expression of dominant negative form of downstream signaling components similarly inhibited the NMJ overgrowth phenotype in unc-104bris mutants. What is more, downregulation of the Wnd MAPK pathway also rescues the AZ assembly and SSR underdevelopment phenotype in unc-104bris mutants. No ameliorated axonal transport is observed in unc-104bris;wnd double mutant larvae, suggesting that the rescuing effects of Wnd MAPK pathway downregulation is independent of axonal transport. An E3 ubiquitin ligase, Highwire (Hiw) has been shown to negatively regulate Wnd level and hence inhibit the Wnd MAPK pathway. Actually, loss of function mutation in hiw and Wnd overexpression both lead to AZ assembly phenotype reminiscent of unc-104bris mutants without causing obvious axonal transport defects. Therefore, we propose that Wnd MAPK overactivation is underlining the synaptic development phenotype in unc-104bris mutants. The level of Hiw is decreased in unc-104bris mutants, which may lead to increased Wnd level and contribute to MAPK overactivation. Importantly, despite the ameliorated NMJ morphology, downregulating MAPK pathway in unc-104bris mutants rescues neither the locomotion impairment nor larval lethality, suggesting that other crucial MAPK independent functions of Unc-104 is important for normal larval activity and survival.

In summary, this work shows that Unc-104, the Drosophila kinesin-3, is an important regulator of synaptic development. A novel function of Hiw as well as the Wnd MAPK pathway in regulating active zone assembly is indentified. Unc-104 controls the level of Hiw, and further modulates Wnd MAPK pathway activity to promote normal synaptic development.

Synaptische Entwicklung ist ein sehr komplexer und dynamischer Prozess. Bisher sind regulierenden Mechanismen synaptischer Entwicklung immer noch nicht gut verstanden. In dieser Studie wird der neuromuskulären Synapse Drosophila als Modell, um Mechanismen der Regulation synaptischer Entwicklung untersuchen verwendet. Eine unvoreingenommene vorne genetisches Screening identifiziert unc-104bris, die eine Missense-Mutation eines konservierten Rest (R561H) im Gabelkopf associated (FHA)-Domäne des Drosophila Kinesin-3 Homolog Unc-104 ist. unc-104bris Larven haben die synaptischen Phänotyp, dass etwa 30% der glutamatergen Synapsen an der neuromuskulären Synapse (NMJ) frei von der präsynaptischen aktiven Zone (AZ) Protein Bruchpilot (BRP) sind , während in Wildtyp-Larven weniger als 5% der Synapsen, die entstehenden Mangel präsynaptischen Brp sind. Darüber hinaus haben unc-104bris NMJ viel kleineren synaptischen Boutons und die subsynaptischen Retikulum (SSR), eine aufwendige membranöse Struktur, die durch den Muskel Membran, die die NMJ umgibt, ist nicht gut entwickelt. unc-104bris Larven sterben bei späten dritten Larvenstadium Bühne / frühen Puppenstadium und leiden unter schweren Beeinträchtigungen Fortbewegung. Das Ziel dieser Studie ist es, systemisch charakterisieren die synaptischen Montage Phänotyp und die Mechanismen unterstreicht die gestörte synaptische Entwicklung im unc-104bris Mutanten zu identifizieren. In der ersten Reihe von Experimenten, finde ich, dass die Menge der insgesamt Brp an der unc-104bris NMJ auf die Hälfte, dass in Wildtyp sinkt. Übermäßige Brp Kaution wird am Zellkörper Bereich der ventralen Nerven-Cord (VNC) im unc-104bris mutierten Larven gefunden. Jedoch kann die verringerte Bildung Brp Puncta an präsynaptischen aktiven Zone nicht vollständig durch eine verminderte Brp Menge zurückgeführt warden. Darüber hinaus sind weitere aktiven Zone Komponenten auch von der Brp (-) Synapsen im unc-104bris NMJs, was darauf hindeutet, dass die AZ Montage wird in diesen Synapsen abgeschafft. Lokalisierung von synaptischen Vesikel (SV), SV assoziierte Proteine und Peptide gefüllt dense core vesicles (DCV) sind stark an der unc-104bris mutierten NMJ als Folge der reduzierten Kinesin-3-Funktion reduziert. Synaptische Aktivität wird auch an der unc-104bris NMJs beeinträchtigt, was durch präsynaptische Reexpression von unc-104 cDNA gerettet werden. Postsynapticly wird Recuitment des inotropen glumate Rezeptor-Untereinheit GluRIIA, aber nicht GluRIIB selektiv an der unc-104bris NMJ reduziert, was bedeutet, dass eine Regulierung transsynaptische Signalisierung Rezeptor-Clustering durch Mutation gestört wird in diesem neuronale Kinesin. In der zweiten Reihe von Experimenten, wird der Mechanismus der synaptischen Entwicklung Phänotyp in unc-104bris Mutanten untersucht. unc-104bris mutierten NMJs haben viel kleinere synaptischen Bouton, der von insgesamt verdoppelt NMJ Länge begleitet wird. Dies ähnelt sehr der NMJ Überwucherung Phänotyp in Larven, die Dual-Leucin-Zipper-Kinase (DLK, das Drosophila Homolog von denen Wallenda (Wnd) ist) Aktivität gesteigert haben. In der Tat, die Herunterregulieren MAPK-Weg durch den Verlust der Funktion Mutation in Wnd, oder Expression von dominant negativen Form der nachgeschalteten Signalkomponenten ähnlich hemmte die NMJ Überwucherung Phänotyp in unc-104bris Mutanten. Hinzu kommt, dass Herunterregulation der MAPK Signalweg auch rettet die AZ Montage-und SSR Unterentwicklung Phänotyp in unc-104bris Mutanten. Kein gebessert axonalen Transport wird in unc-104bris; wnd Doppelmutante Larven beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Auswirkungen der Rettung Wnd MAPK Herunterregulation unabhängig von axonalen Transport ist. Eine E3-Ubiquitin-Ligase, Highwire (Hiw) wurde gezeigt, dass negativ regulieren Wnd Menge kann und somit die Hemmung Wnd MAPK-Weg. Loss of function-Mutation in Hiw und Wnd Überexpression führen beide zu AZ Montage Phänotyp erinnert an unc-104bris Mutanten ohne dass offensichtliche Mängel axonalen Transport. Daher schlagen wir vor, dass Wnd MAPK Überaktivierung unterstreicht die synaptische Entwicklung Phänotyp in unc-104bris Mutanten. Die Höhe der Hiw wird im unc-104bris Mutanten verringert, was kann dazu führen, Wnd Menge erhöht und tragen zur Überaktivierung MAPK. Wichtig ist, dass trotz des gebessert NMJ Morphologie, Herunterregulieren MAPK Signalweg in unc-104bris Mutanten rettet weder die Fortbewegung Beeinträchtigung noch larvale Letalität, was darauf hindeutet, dass andere wichtige MAPK unabhängige Funktionen von Unc-104 ist für den normalen Larven-Aktivität und das Überleben wichtig. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, Unc-104, die Drosophila Kinesin-3, ein wichtiger Regulator der synaptischen Entwicklung ist. Eine neue Funktion von Hiw sowie die Wnd MAPK bei der Regulierung aktiven Zone Anordnung wird identifiziert. Unc-104 steuert den Menge des Hiw, und weiter moduliert MAPK Aktivität auf normale synaptische Entwicklung zu fördern.