Neue Methoden und Forschungs-Ansätze zur Bedeutung von microRNAs in der Leber und in Hepatozyten

Abstract

MicroRNAs sind einzelsträngige, nicht kodierende RNA Moleküle mit einer Länge von ca. 22 Nukleotiden, die durch Bindung an Erkennungssequenzen einer Ziel-mRNA deren Translation und/oder Stabilität beeinflussen können. Einige neuere Beispiele zeigen, dass microRNAs auch die Expression von so genannten ADME (absorption, distribution, metabolism, and excretion) Genen, die für den Fremdstoffmetabolismus eine herausragende Rolle spielen, beeinflussen können. Die inter-bzw. intraindividuelle Variabilität dieser Gene konnte jedoch bisher nicht vollständig durch genetische Polymorphismen oder andere Mechanismen (z.B. der transkriptionellen Genregulation) erklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Strategien entwickelt, um die Rolle von microRNAs bei der Regulation der Expression von fremdstoffmetabolisierenden Genen bzw. ADME Genen in silico, in vitro und ex vivo zu untersuchen und zu belegen. Durch die Entwicklung eines neuen Programms (MIRNA-DISTILLER) zur interaktiven und integrativen Bearbeitung von microRNA Vorhersagedaten, war es möglich das zeitaufwendige Datenmanagment zu erleichtern. Des Weiteren wurden lentivirale Methoden zur Überexpression und Knock-down von in der Leber exprimierten microRNAs in primären humanen Hepatozyten etabliert, um anschließend Änderungen der Expression von ADME Genen auf mRNA-, Protein- und Aktivitätsebene zu detektieren und Rückschlüsse auf mögliche regulatorische Zusammenhänge zu ziehen. Zusätzlich wurde ein Modellsystem zur Untersuchung von Regulationen der miRNA-Expression selbst durch nukleäre Rezeptoren in Hepatozyten am Beispiel von CAR (constitutive androstane receptor) entwickelt. Es wurde gezeigt, dass die Expression bestimmter microRNAs durch CAR reguliert wird. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass Medikamente, die Aktivatoren von CAR oder anderen nukleären Rezeptoren sind, eine Änderung des microRNA Profils in der Zelle zur Folge haben können. Ein weiterer Teil der Arbeit stellte die Quantifizierung von 64 leberrelevanten microRNAs in Proben der Leberbank dar. Mit den in den Leberproben quantifizierten microRNAs und unter Berücksichtigung der klinischen Meta-Daten der Donoren wurden Assoziationsanalysen durchgeführt. Dabei konnten starke Assoziationen von miR-130b, miR-132, miR-21 und miR-34 mit Cholestase entdeckt werden. Diese microRNAs waren in den Leberproben cholestatischer Patienten ca. 3-fach erhöht. Ein plausibler kausaler Zusammenhang zwischen diesen erhöhten microRNAs und Cholestase wurde mittels Literaturhinweisen bekannter Zielgene postuliert. Diese neuen Erkenntnisse könnten dazu beitragen unerwartete Arzneimittelwirkungen besser zu verstehen und möglicherweise neue Diagnose- oder Therapieansätze für Krankheiten wie z.B. Cholestase zu ermöglichen.

MicroRNAs (miRNA) are small non-coding RNA molecules which regulate gene expression mainly at the post-transcriptional level. Recently some microRNAs have been shown to influence the expression of ADME (absorption, distribution, metabolism, and excretion) genes which are important for detoxification of drugs and xenobiotics. The inter- and intraindividual variability of these genes contributes significantly to unpredictable and adverse drug response. Polymorphisms and other mechanisms such as transcriptional gene regulation only partially explain the different drug response phenotypes, hence miRNAs could be taken into consideration. To investigate the role of miRNAs in ADME gene regulation, different strategies were established including in silico, in vitro and ex vivo methods. To facilitate systematic analyses of miRNA prediction data MIRNA-DISTILLER, a stand-alone program was developed. This program provides interactive and integrative processing of miRNA prediction data from different databases for a large gene set. Lentiviral cell-transduction methods were established to over-express and knock-down liver specific miRNAs in primary human hepatocytes to subsequently measure expression of ADME gene mRNA, protein and activity. A model system to investigate transcriptional regulation of miRNAs by the nuclear receptor CAR (constitutive androstane receptor) in hepatocytes was also developed. Influences of miRNA expression after CAR knock-down and/or activation were observed. Furthermore quantifications of 64 important liver miRNAs in liver tissues were carried out for further association studies with clinical meta-data of that liver collection. Strong associations of miR-21, miR-34a, miR-130b and miR-132 and cholestasis were observed. These new insights may contribute to a better understanding of adverse drug reactions and may facilitate diagnostic and therapeutic approaches in diseases.