Inhaltszusammenfassung:
Die aus dem Marianengraben isolierten Stämme Dermacoccus abyssi MT 1.1 und D. sp. MT 1.2 sind als Produzenten von sieben neuartigen Phenazin-Derivaten, den Dermacozinen A - G, bekannt. Bei Kultivierung von Dermacoccus sp. MT 1.2 wurden neun weitere Substanzen identifiziert, die aufgrund ihrer UV-Vis-Spektren ebenfalls den Phenazinen zugeordnet wurden.
Die Produktion dieser Metabolite konnte im Rahmen dieser Arbeit deutlich erhöht werden, indem das Kultivierungsmedium und die Fermentationsbedingungen optimiert wurden. Dabei stellte sich der Zusatz von Glucose und CaCO3 als besonders effektiv heraus. Im 10 Liter-Bioreaktor zeigte sich, dass die Verwendung von Vorkulturen, die zunächst unter Schütteln und anschließend stehend inkubiert worden waren, nicht nur die Schaumbildung herabsetzten, sondern auch die Produktion aller Zielsubstanzen verdoppelte. Die Dermacozine K, L, P, W, Z, RT 2.3, RT 3.37, RT 4.6 und RT 6.8 wurden als Reinsubstanzen isoliert. Des Weiteren konnte die chemische Struktur von Dermacozin K, L, Z und RT 3.37 aufgeklärt werden.
In biologischen Aktivitätstests stellte sich heraus, dass einige der isolierten Substanzen sehr gute antioxidative Eigenschaften aufweisen, wohingegen nur geringe bzw. gar keine antibakterielle, antifungische, antitumorale bzw. enzymhemmende Wirkungen festgestellt wurden.
Zur Identifizierung der für die Dermacozin-Produktion verantwortlichen Biosynthesegene wurde eine Cosmid-Genbibliothek von Dermacoccus sp. MT 1.2 hergestellt und erfolgreich nach zwei essentiellen Grundgenen des Phenazin-Genclusters durchsucht. Die vollständige Sequenzierung eines ausgewählten Cosmids führte zu dem Ergebnis, dass das ca. 40 kb große Insert alle essentiellen Phenazin-Grundgene (phzB, phzD, phzE, phzF und phzG) sowie sechs weitere Gene, die vermutlich an der Modifikation des Phenazin-Grundkörpers beteiligt sind, beinhaltet. Darunter befanden sich u. a. phzH und phzM, die in anderen Phenazin-Produzenten eine Rolle bei der Modifikation von Phenazin-1-Carbonsäure bzw. Phenazin-1,6-Dicarbonsäure spielen.
Des Weiteren wurden vier mögliche regulatorische und ein potentielles Resistenz- bzw. Exportgen identifiziert. Anhand der Ergebnisse der bioinformatischen Analysen wurde ein Modell für die Biosynthese der Dermacozine erstellt. Allerdings konnte mittels heterologer Expression in Streptomyces lividans nicht festgestellt werden, ob es sich um das für die Reaktionsabfolge der Dermacozin-Biosynthese verantwortliche Gencluster handelt, da die Exokonjuganten keine Phenazine produzierten. Dies wurde selbst durch Klonierung eines konstitutiven Promotors vor das erste Phenazin-Grundgen nicht erreicht.
Abstract:
The two strains Dermacoccus abyssi MT 1.1 and D. sp. MT 1.2 isolated from the Mariana Trench are known as producers of seven novel phenazine derivatives, the dermacozines A - G. During cultivation of Dermacoccus sp. MT 1.2 nine additional compounds were identified which were also designated to the phenazine family due to their UV-Vis-spectra. In this work the produced amounts of these metabolites were increased by optimization of the culture media and fermentation conditions. The addition of glucose and CaCO3 had the most notable effect. For fermentation in 10 litre bioreactors the treatment of precultures as combination of shaking and standing cultivation led to a reduced foam formation as well as to an increased production of all target metabolites. The dermacozines K, L, P, W, Z, RT 2.3, RT 3.37, RT 4.6 and RT 6.8 were purified and the chemical structures of dermacozines K, L, Z and RT 3.37 were elucidated.
In biological assays some of the isolated compounds turned out to be strong antioxidants whereas all of them showed no or low enzyme inhibition, antibacterial, fungicidal and cytotoxic activities.
To identify the responsible dermacozine gene cluster a cosmid genome library of the Dermacoccus strain MT 1.2 was prepared and screened successfully for two essential phenazine core genes. The complete sequencing of one cosmid led to an 40 kb insert that contained all essential phenazine core genes (phzB, phzD, phzE, phzF and phzG) as well as six possible genes involved in the modification including phzH and phzM. In other phenazine producers these two genes play an important role in the modification of the phenazine-1,6-dicarboxylic acid and phenazine-1-carboxylic acid. Moreover, four possible regulating genes and one transport or resistance gene were identified within the gene cluster. Based on bioinformatic analysis a dermacozine biosynthesis model was elaborated. However, the verification of the gene cluster responsible for the dermacozine biosynthesis could not be achieved by heterologous expression in Streptomyces lividans; all tested exoconjugants did not produce phenazines. This was also the case if a constitutive promotor was cloned in front of the first phenazine core gene.
Dermacozines