Mechanism of microRNA-mediated mRNA Decay

Abstract

Cells highly regulate protein production at any step of gene expression in order to adapt to the specific situation they are in. To this end, cells not only control mRNA levels transcriptionally, but also post-transcriptionally. In the last years a multitude of post-transcriptional gene regulation pathways have been described, but a deep mechanistic understanding at the molecular level of these pathways has not been achieved yet in many cases. However, a common outcome that emerged from previous studies was that despite their diversity, these pathways employ a similar set of general translation regulators and mRNA decay factors at the effector steps. Therefore, studying these general mRNA effector proteins promises to increase our general understanding of regulated gene expression. During my PhD thesis I studied the mRNA decay pathway as a mechanism of post-transcriptional gene regulation. In particular, I focused on mRNA deadenylation and decapping, the key steps of mRNA decay. Despite their importance the mechanistic insight into these mRNA degradation processes had been limited, especially in metazoa. Therefore, I chose Drosophila melanogaster (Dm) and Homo sapiens (Hs) as model systems to study both mRNA deadenylation and decapping. Furthermore, I studied the microRNA (miRNA) pathway to understand in detail how this pathway employs the general mRNA degradation factors. In the first part of my thesis, I systematically dissected the proteins involved in mRNA decapping and the protein complexes they form to promote mRNA decay taking as examples the Decapping protein 1 (DCP1), DDX6/Me31B and Pat. I mapped the connectivity, domains and functional sequences of the metazoan decapping complex in the model systems Dm and Hs as well as their relevance for assembly of decapping activator complexes and mRNA degradation in vitro and in cells. A study on the role of the DCP1 revealed an unexpected complexity and connectivity of decapping activator complexes. Another project focused on the assembly of mutually exclusive complexes with the helicase DDX6/Me31B as common partner and provided an explanation at the molecular level of how this helicase can exert diverse functions in mRNA regulation. Together with a study on the decapping activator Pat, this work challenged the so far prevailing concept of a static super-decapping activator complex. These two studies rather suggest that distinct sub-complexes of decapping activators are formed and disassemble dynamically due to mutually exclusive interactions between the decapping factors. In the second part of my PhD project, I studied how the miRNA pathway recruits the general mRNA decay machinery to promote degradation of miRNA targets. Growing evidence from recent literature suggested that mRNA degradation is a widespread consequence of miRNA regulation. However, the mechanism of how miRNAs promote target degradation remained elusive. Here, I could identify a direct link between the core silencing machinery and two deadenylation factors. These proteins in turn recruit their respective deadenylation complexes to the mRNA targets to promote deadenylation. My work provides a mechanistic connection between miRNA guided target recognition and target degradation and shows how cellular pathways that have been previously seen as distinct are actually highly interconnected.

Um sich an ihre spezielle Situation anzupassen, regulieren Zellen in hohem Maße die Proteinproduktion in jedem Schritt der Genexpression. Dazu kontrollieren Zellen die Mengen an Boten-RNA (mRNA) nicht nur während der Transkription, sondern auch posttranskriptional. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von posttranskriptionalen Genregulationswegen beschrieben, wobei jedoch in vielen Fällen ein tiefes mechanistisches Verständnis dieser Regulationswege auf molekularer Ebene noch nicht erlangt wurde. Bisherige Studien haben gezeigt, dass diese Regulationswege trotz ihrer Verschiedenheit ein ähnliches Sortiment von generellen Translationsregulatoren und mRNA-Abbaufaktoren als Effektormoleküle einsetzen. Eine Untersuchung dieser generellen mRNA-abbauenden Proteine verspricht daher, unser allgemeines Verständnis der Regulation der Genexpression zu erweitern. In meiner Doktorarbeit habe ich den mRNA-Abbauweg als einen Mechanismus von posttranskriptionaler Genregulation untersucht. Insbesondere habe ich mich auf die mRNA-Deadenylierung und die Hydrolyse der mRNA-5‘-Kappenstruktur (Decapping), die Schlüsselschritte des mRNA-Abbaus, fokussiert. Trotz ihrer Bedeutung war nur eine eingeschränkte mechanistische Erkenntnis in diese mRNA-Abbauprozesse vorhanden, insbesondere in Vielzellern. Ich habe daher Drosophila melanogaster (Dm) und Homo sapiens (Hs) als Modellsysteme ausgewählt, um sowohl mRNA-Deadenylierung als auch Decapping zu untersuchen. Des Weiteren habe ich den microRNA (miRNA)-Weg untersucht um eingehend zu verstehen, wie dieser Weg die generellen mRNA-Abbaufaktoren einsetzt. Im ersten Teil meiner Doktorarbeit habe ich systematisch die mRNA-Decapping-Proteine und ihre Proteinkomplexe, die sie bilden, um den mRNA-Abbau voranzutreiben, an den Beispielen von Decapping protein 1 (DCP1), DDX6/Me31B und Pat untersucht. Ich habe die Verbindungen, Domänen und funktionalen Sequenzen des Decapping-Komplexes in Vielzellern in den Modellsystemen Dm und Hs bestimmt, sowie deren Bedeutung für den Aufbau von Decapping-Aktivator-Komplexen und mRNA-Abbau in vitro und in Zellen. Die Untersuchung zur Rolle von DCP1 hat eine unerwartete Komplexität und Verbindung im Aufbau von Decapping-Aktivator-Komplexen gezeigt. Ein anderes Projekt konzentrierte sich auf den Aufbau der sich gegenseitig ausschließenden Komplexe mit der Helikase DDX6/Me31B als gemeinsamen Partner und bietet auf molekularer Ebene eine Erklärung dafür, wie diese Helikase unterschiedliche Funktionen bei der Regulation von mRNAs ausüben kann. Zusammen mit einer Untersuchung des Decapping-Aktivators Pat hat diese Arbeit das bis dahin vorherrschende Modell eines statischen Super-Decapping-Aktivatoren-Komplexes in Frage gestellt. Diese beiden Studien weisen eher auf verschiedene Unterkomplexe von Decapping-Aktivatoren hin, die sich durch sich gegenseitig ausschließende Wechselwirkungen dynamisch bilden und auflösen können. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit habe ich untersucht, wie der miRNA-Weg die generelle mRNA-Abbau-Maschinerie heranzieht, um mRNA-Angriffsziele der miRNAs beschleunigt abzubauen. Eine wachsende Zahl an Belegen in der neueren Literatur legte nahe, dass mRNA-Abbau eine weitverbreitete Folge der Regulation durch miRNAs ist. Jedoch blieb der Mechanismus, wie miRNAs ihre Angriffsziele beschleunigt abbauen, unklar. Hier konnte ich eine direkte Verbindung zwischen der Kernkomponente des miRNA-Weges und zwei Deadenylierungsfaktoren bestimmen. Diese Proteine wiederum bringen ihre jeweiligen Deadenylierungs-Komplexe zu mRNA-Angriffszielen heran, um sie zu deadenylieren. Meine Arbeit liefert eine mechanistische Verbindung zwischen miRNA-geleiteter Angriffszielerkennung und Angriffszielabbau und zeigt, wie zelluläre Wege, die bisher als voneinander unabhängig betrachtet wurden, tatsächlich stark miteinander vernetzt sind.