Disease Underlying Genetics in Ileal Crohn’s Disease: Disturbed Antimicrobial Defense and Impaired Wnt Signaling at the Epithelial Barrier

Abstract

The human intestinal barrier is constantly challenged by ingested pathogens and a complex commensal flora. To fend off and control the large amount of microbes, the epithelial lining critically depends on innate antimicrobial peptides. Before the major importance of these innate defense molecules became evident, scientists who were investigating Inflammatory Bowel Diseases (IBD) supported an autoimmune pathogenesis concept for the severe reoccurring inflammations in the intestinal tract. More than 10 years ago, when it became evident that gut bacteria form the major target for activated immune cells which underlie the inflammatory symptoms in IBD, the research focus started to shift towards investigations on primary barrier defects. For Crohn’s disease (CD), a major form of IBD, different location specific impairments in the epithelial production of antimicrobials have been identified. These not only explain the stability of disease location, but also accommodate an inherited and an environmental component in the disease. In small intestinal CD, such impairments are found in the transcriptional expression and in the storage/secretion of Paneth cell (PC) derived human defensin (HD)-5 and -6. Very recently, the transcription factor TCF7L2 was introduced in the context of their decreased mRNA levels in patients. TCF7L2 is not only a major player in beta- catenin dependent Wnt signaling and consequently intestinal epithelial proliferation and Paneth cell maturation, but also directly regulates the transcriptional expression of HD5 and -6.

The main goal of my studies was to further elucidate the primary role of antimicrobial peptides in CD and especially the influence of defective Paneth cell function. This was in large parts done by investigations on underlying genetic mechanisms which affect the Wnt pathway. In 3 DNA sets with together more than 3000 samples, it was possible to elucidate an association of the TCF7L2 putative promotor SNP rs3814570 with ileal CD. In a subsequent approach the Wnt co- receptor LRP6 could also be identified as a new candidate in ileal CD. The hypothesis and literature based candidate gene approach on LRP6 revealed an association of a coding rare variant, which has a negative effect on the co- receptors function, with early onset and penetrating ileal CD. Since the variant seems to precede further diminished HD5 levels in patients, it might explain reduced antibacterial killing in some affected individuals. More importantly, like the association of TCF7L2, it supports the role of primary Paneth cell defects as a major mechanism in the disease. Besides being affected on the genetic level in certain disease subgroups, LRP6 also shows diminished mRNA expression in small intestinal CD in general. This might be an additional and more general mechanism preceding reduced Paneth cell antimicrobial function, but further research is needed to shed light on the exact circumstances. In a parallel approach regarding the role of antimicrobials in active CD and the effect of standard medication on their expression, it was furthermore possible to confirm a lack of coherency between inflammation severity and diminished Paneth cell alpha- defensins and therefore the primary character of the decrease.

The herein reported results not only help to understand disease underlying mechanisms as they support the concept of defective beta- catenin dependent Wnt in ileal CD, but also underline the importance of reduced antimicrobial function in patients.

Additional investigations will be needed to first elucidate a potential role of defective cell differentiation and secondly to identify new targets for therapeutic approaches in the disease. Such new therapeutics would have to strengthen the innate intestinal barrier and therefore, different from current medications, function as a causative treatment.

Das Darmepithel eines jeden Menschen muss sich ständiger Bedrohungen durch Pathogene erwehren und eine immense Vielfalt kommensaler Mikroorganismen in Schach halten. Um diesen Angriffen standhalten zu können, ist es auf das angeborene Immunsystem und im speziellen auf antibakterielle Peptide angewiesen. Bevor die große Bedeutung dieser körpereigenen Antibiotika aufgeklärt wurde, wurden Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED), schwere wiederkehrenden Entzündungen des Intestinaltrakts, als Autoimmunerkrankung eingestuft. Nachdem jedoch bereits vor über zehn Jahren Darmbakterien als die eigentlichen Auslöser der Symptomatik identifiziert wurden, richteten sich die Forschungsarbeiten auf Barriere-Funktionsstörungen. Für die verschiedenen intestinalen Lokalisationen des Morbus Crohn, einer großen Untergruppe der CED, konnten in Folge dessen spezifische Defekte im System der epithelialen antimikrobiellen Peptide beschrieben werden. Diese Defekte erklären nicht nur das stabile Auftreten der Symptome in definierten Arealen, sondern werden sowohl der erblichen als auch der umweltbedingten Komponente der Krankheit gerecht. Bei Morbus Crohn des Dünndarms gehen Einschränkungen der epithelialen Bakterienabwehr auf Störungen in der Transkription sowie der Speicherung, Abgabe und Aktivierung der Panethzell- „human defensins“ (HD)-5 and -6 zurück. Kürzlich konnte die reduzierte mRNA Expression beider dieser alpha- Defensine zudem mit verminderten Leveln des Transkriptionsfaktor TCF7L2 in Verbindung gebracht werden. TCF7L2 spielt eine ausschlaggebende Rolle im beta- catenin abhängigen Wnt Signalweg und ist folglich wichtig für die epitheliale Proliferation sowie die Panethzellreifung und die transkriptionelle Regulation von HD5 und -6.

Die hierin präsentierten Arbeiten beschäftigen sich mit der weitere Untersuchung der Rolle antimikrobieller Peptide und im Besonderen des Einflusses gestörter Panethzellfunktion bei Morbus Crohn. Das Hauptaugenmerk lag dabei in der Identifikation und Aufklärung genetischer Pathogenesemechanismen die den Wnt Signalweg betreffen. In den dafür untersuchten und analysierten großen CED DNA Kohorten, konnte ein im putativen Promotor von TCF7L2 lokalisierter SNP (rs3814570) mit Morbus Crohn des Dünndarms assoziiert werden. In einem weiteren Studienansatz war es zudem möglich den Wnt Ko-rezeptor LRP6 als einen neuen Faktor in der Erkrankung einzustufen. In einer auf Literaturrecherche basierender und hypothesengetriebener Kandidatengenstudie, konnte eine funktionelle SNP- Variante mit besonders früh auftretender und penetrierender Symptomatik des Dünndarmcrohns assoziiert werden. Da die Variante potentiell zu einer weiteren Verminderung in der HD5 Transkription führt, erklärt sie somit teilweise die gestörte antibakterielle Funktion einiger Patienten und unterstreicht, wie auch die Assoziation des Kandidatengens TCF7L2, die zentrale Rolle der Panethzelle. Neben der genetischen Beeinträchtigung in einigen Untergruppen, weist LRP6 zusätzlich eine allgemein verminderte mRNA Expression im Epithel von Dünndarmcrohnpatienten auf. Dies stellt unter Umständen einen allgemeineren Pathomechanismus dar, der weitere Untersuchungen zur genaueren Aufklärung bedarf. Parallel zu den genetischen Analysen, konnte in einer Untersuchung betreffend antimikrobieller Peptide und deren mögliche Beeinflussung durch Standardmedikation bei aktivem Morbus Crohn, ein fehlender Zusammenhang zwischen der Entzündungsstärke und verminderter HD5 und -6 Expression bestätigt werden.

Die hier zusammengetragenen Ergebnisse unterstützen nicht nur das Konzept eines Wnt- Signalwegdefektes als Pathogenesemechanismus bei Morbus Crohn des Dünndarms, sondern unterstreichen in ihrer Gesamtheit auch die tragende und primäre Rolle reduzierter antimikrobieller Abwehr in Patienten. Weitere Untersuchungen werden nötig sein um eine eventuelle Beteiligung gestörter Zelldifferenzierung aufzuklären und um neue Therapiemöglichkeiten aufzudecken. Solch neue Optionen sollten im Gegensatz zur derzeit verwendeten Standardmedikation gezielt die angeborene Barrierefunktion unterstützen und daher als kausale Therapie fungieren.