Evaluation of Direct and Indirect Mechanisms of Microbial Influence on Natural Organohalogen Formation

Abstract

Volatile halogenated organic compounds (VOX) are known as potent pollutants, ozone-destroying agents and carcinogens of anthropogenic origin - neglecting that many VOX also have natural sources. While VOX are produced naturally through combustion of biomass (e.g. forest fires) and volcanic eruptions, soils also contribute significantly to the emission of several VOX on a global scale. Previous laboratory studies constrained the biogeochemical conditions under which soils can emit VOX, such as acidic pH combined with the presence of chloride, catalytic amounts of iron (Fe) and organic radicals or the activity of halophilic microorganisms in salt lake sediments, which are naturally rich in halides. However, detailed mechanisms of VOX formation in soil remain to be elucidated. Another question that is still open is if, how, and to which extent microorganisms can influence natural VOX formation in terrestrial environments. Therefore, the goals of this thesis were I) to determine whether Fe(III)-reducing microorganisms can indirectly stimulate natural VOX formation by producing reactive Fe phases and organic radicals that initiate abiotic reactions involved in VOX formation, II) to elucidate the role of microorganisms that express halogenating enzymes in salt lake sediments in direct production of VOX, and III) to investigate whether VOX-degrading, dehalorespiring microorganisms, whom naturally produced organohalogens could serve as substrates, are present in salt lake sediments. One major finding of this thesis is that the potential of microorganisms to reduce Fe(III) at acidic pH (unlike under neutral pH) is not necessarily coupled to their ability to reduce humic substances and to initiate the formation of organic radicals. Further results of this thesis call into question whether, according to our hypothesis, microorganisms play any indirect role in natural VOX formation while it remains hard to judge their direct influence on this process: the addition of neutrophilic Fe(III)-reducing bacteria to a methyl chloride-emitting salt lake sediment sample did not lead to an increase in production of the VOX methyl chloride. However, Fe(III)-reducing as well as Fe(II)-oxidizing and humic substance-reducing microorganisms were enriched from different salt lake sediments and shown to be active in medium with up to 5 M NaCl, suggesting that independent of their contribution to VOX emissions, these groups of microorganisms probably play an ecological role in salt lake sediments. Furthermore, it was found that the diversity of microbial genes encoding halogenating enzymes that can produce VOX as determined by DNA sequence variation is too high to study them by PCR-based screening with only one set of degenerate primers. To address this problem, multiple sets of degenerate primers were designed and successfully used to screen selected subgroups of halogenation genes. Halogenation genes were not found in any of the 18 salt lake sediments studied. One conclusion from this result is that even though the products of these genes likely contribute to global VOX emissions, it is difficult to elucidate the identity of the most significant enzymes, the organisms that harbor them and the conditions under which they are expressed. Furthermore, no signs of presence or activity of chlorinated ethene-respiring bacteria could be detected by PCR and microcosm experiments, suggesting VOX-degrading microorganisms are not important in salt lake sediments. Although we are still beginning to understand the influence of microorganisms on natural organohalogen formation (and degradation), this work suggests that in salt lake sediments, microorganisms seem to have little role in either production or degradation of VOX.

Flüchtige halogenierte organische Verbindungen (VOX) sind als schädliche, ozonzerstörende Substanzen und Karzinogene anthropogener Herkunft bekannt - wodurch vernachlässigt wird, dass viele VOX auch natürliche Quellen haben. Während VOX bei der Verbrennung von Biomasse (z.B. bei Waldbränden) und bei Vulkanausbrüchen auf natürliche Weise produziert werden, so tragen auch Böden in einem Maßstab zur Emission verschiedener VOX bei, der von globaler Bedeutung ist. Frühere Laborstudien haben die biogeochemischen Bedingungen, unter welchen Böden VOX emittieren, genauer definiert. Hierzu gehören z.B. ein saurer pH in Kombination mit Anwesenheit von Chlorid, katalytischen Mengen an Eisen (Fe) und organischen Radikalen oder die Aktivität von salzliebenden Mikroorganismen in Salzseesedimenten, die natürlicherweise reich an Halogeniden sind. Die genauen Mechanismen, die zur VOX-Bildung im Boden führen, bleiben jedoch noch zu erforschen. Des Weiteren ist die Frage offen, ob, wie und in welchem Ausmaß Mikroorganismen die natürliche Bildung von VOX in terrestrischer Umgebung beeinflussen können. Aus diesem Grund bestanden die Ziele dieser Arbeit darin I) herauszufinden, ob Fe(III)-reduzierende Mikroorganismen die natürliche Bildung von VOX auf indirekte Weise stimulieren können, indem sie reaktive Eisenphasen und organische Radikale produzieren, die wiederum abiotische Reaktionen in Gang setzen, welche letztendlich zur VOX-Bildung führen, II) die Rolle von Mikroorganismen zu klären, welche in Salzseesedimenten halogenierende Enzyme produzieren, die auf direktem Wege VOX produzieren und III) zu untersuchen, ob VOX-abbauende, dehalorespirierende Mikroorganismen, denen auf natürliche Weise produzierte Organohalogene als Substrate dienen könnten, in Salzseesedimenten vorhanden sind. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit besteht darin, dass das Potential von Mikroorganismen, unter sauren pH-Bedingungen Fe(III) zu reduzieren im Gegensatz zu demselben Vorgang bei neutralem pH nicht notwendigerweise mit der Fähigkeit einhergeht, Huminstoffe zu reduzieren und hierdurch die Bildung organischer Radikale zu initiieren. Weitere Ergebnisse dieser Arbeit stellen infrage, ob Mikroorganismen entsprechend unserer Hypothese eine indirekte Rolle bei der natürlichen VOX-Bildung spielen, während es schwer bleibt, ihren direkten Einfluss auf diesen Prozess zu beurteilen: so führte die Zugabe neutrophiler Fe(III)-reduzierender Bakterien zu einem Methylchlorid emittierenden Salzseesediment nicht zu einem Anstieg der Bildung des Organohalogens Methylchlorid. Allerdings konnten sowohl Fe(III)-reduzierende als auch Fe(II)-oxidierende und Huminstoff-reduzierende Mikroorganismen aus Salzseesedimenten angereichert und deren Aktivität in Medium mit einem Salzgehalt von bis zu 5 M NaCl nachgewiesen werden. Unabhängig davon, ob diese Organismen zu VOX-Emissionen beitragen, legt dieses Ergebnis nahe, dass diese mikrobiellen Gruppen in Salzseesedimenten wahrscheinlich von ökologischer Bedeutung sind. Darüber hinaus hat sich herausgestellt, dass die Diversität von Genen, welche für halogenierende Enzyme codieren, die VOX produzieren können, auf der Basis von DNA-Sequenzvariationen zu groß ist, um diese mit einem PCR-Screen mit nur einem Set von degenerierten Primern zu untersuchen. Um dieses Problem anzugehen, habe ich mehrere Sets degenerierter Primer designt und erfolgreich dazu verwendet, Untergruppen von Halogenierungsgenen zu screenen. In keinem der 18 untersuchten Salzseesedimente wurden irgendwelche Halogenierungsgene gefunden. Eine Schlussfolgerung aus diesem Ergebnis ist, dass obwohl die Produkte dieser Gene sehr wahrscheinlich zu globalen VOX-Emissionen beitragen, es sehr schwierig ist, die entsprechenden Gene sowie die Organismen, aus denen sie stammen und die Bedingungen, unter denen sie exprimiert werden, zu identifizieren. Des Weiteren konnten weder durch PCR noch durch Mikrokosmosexperimente irgendwelche Anzeichen der Anwesenheit oder der Aktivität von Mikroorganismen detektiert werden, welche chlorierte Ethene dehalogenieren, was darauf hindeutet, dass in Salzseesedimenten VOX-abbauende Mikroorganismen ökologisch nicht von Bedeutung sind.