Funktionelle Untersuchungen von Colicin M und seinem Immunitätsprotein

Abstract

Bakteriocine stellen eine große Vielfalt an Protein-Antibiotika dar, die von Bakterien zur Abwehr konkurrierender Bakterien produziert werden. Die Protein-Toxine bestimmter Escherichia coli - Stämme werden als Colicine bezeichnet, sind plasmidcodiert und töten Zellen durch Ausbildung von Poren in der Cytoplasmamembran oder den Abbau von Nukleinsäuren. Colicin M wirkt einzigartig als Phosphatase, die die Murein-Biosynthese inhibiert und so zur Lyse der Zellen führt. In meiner Diplomarbeit wurde die Kristallstruktur von Colicin M bestimmt und es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Aktivität eines importierten Proteins von einem einzigen periplasmatischen Chaperon, FkpA, abhängig ist. Da Colicin M nur die äußere Membran passieren muss, ist es besonders geeignet, den Import von Proteinen in das Periplasma zu studieren.

In dieser Arbeit wird Colicin M in der Art seiner Bindung, Aufnahme und Wirkungsweise näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass Colicin M seine Konformation bei der spezifischen Bindung an seinen Rezeptor FhuA in der äußeren Membran ändert. Nachdem es in die Zellen importiert wurde, konnte es aktiv aus dem Periplasma und der Membran extrahiert werden, wobei es nicht möglich war, entfaltetes, inaktives Colicin aus FkpA Mutanten zu gewinnen. Der Schritt der Translokation durch die äußere Membran zum Ziel in das Periplasma ist reversibel, da Colicin M bei einer Erhöhung der Temperatur in einer temperatursensitiven Mutante wieder an die Zelloberfläche gebracht wird und sensitiv gegenüber Colicin M- spezifischen Antikörpern ist. Colicin M wurde bei 30°C in die Zellen importiert, wobei eine Erhöhung der Temperatur auf 42°C die Zellen vor der Toxizität von Colicin M, das durch Antikörper inaktiviert wurde, bewahrte. Die Aufnahme von Colicin M in die Zellen bei 37°C dauerte etwa acht Minuten.

Jedem Colicin ist ein inaktivierendes Immunitätsprotein zugeordnet, das die produzierenden Zellen vor der Wirkung der Colicine schützt. Das Immunitätsprotein von Colicin M ist periplasmatisch nahe dem Substrat Murein in der cytoplasmatischen Membran verankert. Da der Mechanismus der Wechselwirkung von Colicin M und seinem Immunitätsprotein nicht bekannt ist, wurde das Immunitätsprotein kristallisiert, dessen Struktur bestimmt und die Bindung an Colicin M getestet. In Kooperation mit einem Strukturbiologen wurde die Struktur des Immunitätsproteins bei einer Auflösung von 1,9Å mit einer de novo Phasen-Methode bestimmt. Die Struktur des 9kDa großen Proteins stellt ein Dimer dar, dessen Kontaktfläche zwei kovalente Disulfidbrücken, Wasserstoffbrückenbindungen und eine Salzbrücke enthält. Es ist ein hoch geladenes Protein mit einem erheblichen Überschuss negativer Ladungen. Die Bindung von Colicin M an sein Immunitätsprotein konnte nachgewiesen, aber trotz versuchter Ko-Kristallisation und Mutagenese vermutlicher in die Bindung involvierter Reste nicht näher charakterisiert werden.

Bacteriocins are a large variety of protein antibiotics produced by bacteria to fend off competitors. The protein toxins encoded on plasmids of certain Escherichia coli strains are called colicins killing cells by pore formation or nuclease activities. Colicin M acts uniquely as a phosphatase which inhibits murein biosynthesis resulting in cell lysis. In my diploma thesis I contributed to colicin M crystal structure determination and could show for the first time that the activity of an imported protein depends specifically on a single periplasmic chaperone, FkpA. Since colicin M must pass only the outer membrane, it is particularly suited to study the import of a protein into the periplasm.

In the present study, colicin M was characterized further in its way of binding, uptake and way of action. It could be shown that colicin M changes its conformation while specific bound to the FhuA receptor. After imported into cells, active colicin M could be extracted from the periplasm and membrane, but it was not possible to extract unfolded, inactive colicin from FkpA mutants. The step of translocation through the outer membrane to its target in the periplasm is reversible since it is inactivated by colicin M specific antibodies at increased temperature by using a temperature-sensitive FkpA mutant. Colicin M was imported at 30°C but a temperature shift from 30 to 42°C prevented killing and colicin M was inhibited by antibodies. The uptake of colicin M into cells at 37°C lasted approximately eight minutes.

Each colicin has its own inactivating immunity protein, protecting producer cells against the colicin they form. The immunity protein of colicin M is anchored to the periplasmic surface of the cytoplasmic membrane where the substrate of Colicin M is localized. The mechanism of interaction between Colicin M and its immunity protein is not known. To understand this mechanism, the immunity protein was crystallized, its structure determinated and binding to colicin M tested. In cooperation with a structure biologist the structure of the colicin M immunity protein was determined at a resolution of 1.9Å by a de novo phasing method. The structure of the 9kD protein is dimeric mediated by two covalent disulfide bridges, H-bond interactions and a salt bridge. It is a highly charged protein with a significant surplus of negative charges. Binding of colicin M and its immunity protein could be identified but not further characterized by co-crystallisation or mutagenesis of colicin M at residues predicted to be involved in binding of the immunity protein.