Synthese einer Glycopeptidbibiliothek und deren Anwendung in der Festphasensynthese

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur Festphasensynthese von Oligosaccharidmimetika erarbeitet und die Eignung der Methode in Bezug auf die Möglichkeit der Bindung der Oligosaccharidmimetika an die kohlenhydraterkennenden Zentren von Proteinen getestet und verifiziert. Hierfür wurden drei verschiedene Festphasen auf der Basis von Zellulose, sauerstoffderivatisiertem Polystyrol und Glas bezüglich ihrer Eignung für die Oberflächensynthese von Glycopeptiden als Oligosaccharidmimetika getestet. Als Ergebnis lässt sich hierbei feststellen, dass alle drei gewählten Festphasen sich prinzipiell für die Synthese eignen, dass Glas allerdings die besten Ergebnisse bezüglich Resistenz gegenüber den verwendeten Lösungsmittteln und der Reproduzierbarkeit der Derivatisierung zeigt. Die Lösungsmittelstabitität von Polystyrol erwies sich trotz der Umstellung des Lösungsmittelsystems als problematisch. Cellulose zeigt zwar prinzipiell den höchsten Derivatisierungsgrad, jedoch ist die Reproduzierbarkeit gering. Darüber hinaus ist Aufgrund des quellens der Festphase bei den Waschvorgängen die Vollständigkeit der Waschvorgänge schwer zu gewährleisten. Außerdem sind die Waschvorgänge wesentlich zeitaufwendiger und verbrauchen mehr Lösungsmittel als bei einer Glasfestphase. Schließlich wurde eine umfassende Bibliothek von Glycopeptidbuildingblocks für die Synthese von Oligosaccharidmimetika dargestellt. Hierfür wurden Desoxyazidoderivate der Glucose an den Positionen 1, 2, 3, und 6, der Galactose an den Positionen 1, 2, 3, 4 und 6 synthetisiert. Außerdem wurden die anomeren Azide des Glucosamins und des Galactosamins und das 6-Desoxyazidoglucosamin dargestellt. Darüber hinaus wurde ein Sialinsäurederivat, dass an der Position 9 ein Azid trägt, und ein Azidoethylglycosid der Sialinsäure synthetisiert. Die Glucose und die Galactose wurden ebenso als Azidoethylglycoside eingesetzt. Des Weiteren wurden die Glucose und die Galactose jeweils an den Hydroxygruppen an den Positionen 2,4 und 6 mit Azidoethylethern derivatisiert. Außerdem wurden in 6-Desoxyazido-glucosebausteine am anomeren Zentrum verschiedene Reste wie Methyl-, Phenyl-, Allyl-, Thioethyl-, oder Thiophenylgruppen eingeführt, um deren Einfluss auf Anbindungen an Proteine untersuchen zu können. Diese Azidoderivate wurden in einer 1,3-Dipolaren Cyloaddition mit einem Alkin im Rückgrat zum Triazol gekuppelt. Die Buildingblocks der Glycopeptidbibliothek ließen sich so in Ausbeuten von 62% bis 96% synthetisieren.

Des Weiteren wurden, mit ausgewählten Tetrameren Glycopeptiden, Rückgrate auf der Basis von L-Asparaginsäure und PNA, die Selektivität und die Bindungsstärke der Rückgrate am Beispiel eines Screenings mit Marina Blue gelabeltem PHA-E getestet. Es hat sich dabei gezeigt, dass im Rahmen der getesteten Verbindungen das PNA Rückgrat höhere Anbindungsraten und Selektivitäten zeigte. Zur Bestimmung des Anbindungsgrades wurde sowohl das nicht angebundene gelabelte Protein, als auch das gebundene Protein nach Denaturierung und Entfernen von der Festphase UV-Spektroskopisch vermessen.

Mit einigen Monomeren der Glycopeptidbibliothek wurde dann ein Glycopeptidmicroarray mit 96 Pentameren erstellt. Mit diesem Synthesekonzept konnte bewiesen werden, dass ein komplexes kohlenhydraterkennendes Zentrum das Mimetikum erkennt und somit die Methode als solche verifiziert werden. Hierfür wurde mit Texas Red gelabeltes Cholera Toxin als Protein eingesetzt. Als Ergebnis lässt sich sagen, dass die entwickelte Methode zur Synthese von Oligosaccharidmimetika und zum Screening mit entsprechenden Proteinen geeignet ist, darüber hinaus konnten erste Aussagen bezüglich der Eignung von einzelnen Buildingblocks für das Screening mit Cholera Toxin getroffen werden.

In the present thesis a method for solid phase synthesis of oligosaccharide mimetics has been developed, tested and verified in order to probe the possibility of binding the oligosaccharide mimetics to the carbohydrate recognizing domains of proteins. For this purpose, three different solid phases, namely glass, cellulose and oxygen-derivatized polystyrene, were tested regarding their suitability for solid phase synthesis of glycopeptides as oligosaccharide mimetics. As a result it can be found that all three selected solid phases are in theoretically suitable for the synthesis, however, glass shows the best results in terms of resistance to the solvents used and the reproducibility of the derivatisation. Despite of the change of the solvent system the solvent resistance of polystyrene was found to be problematic. Cellulose shows in general the highest degree of derivatization, but the reproducibility is low. In addition, because of swelling of the solid phase during washing operations the completeness of the washing operations is difficult to ensure. Furthermore, the washing operations need much more time consuming more solvent than needed for glass as solid phase. Finally, a comprehensive library of glycopeptide building blocks for the synthesis of oligosaccharide mimetics was prepared. For this deoxy-azido derivatives of glucose at positions 1, 2, 3, and 6, of galactose at positions 1, 2, 3, 4 and 6 were synthesized. In addition, the anomeric azides of glucosamine and galactosamine and the 6-deoxy-azido glucosamin were prepared. Furthermore a 9-deoxy-azido derivative and a azido-ethyl glycoside of sialic acid were synthesized. The azido-ethyl glycosides of glucose and galactose also were used. Furthermore, glucose and galactose were derivatised with azido-ethyl ethers at the hydroxy groups at the positions 2,4 and 6. In addition, 6-deoxy-azido glucose was used to introduce various groups such as methyl, phenyl, allyl, thioethyl or thiophenyl groups at the anomeric center, in order to investigate their influence on binding to proteins. The azido derivatives were coupled in a 1,3-dipolar cyloaddition with an alkyne in the backbone to the corresponding triazoles. The building blocks of the glycopeptide library were synthesized in yields of 62% to 96%. Furthermore, backbones consisting of PNA or iso-asparagine were tested concerning the selectivity and the bonding strength using a marina-blue labeled PHA-E. For this purpose different tetrameric glycopeptides were used. It has been found that in the context of the compounds tested, the PNA backbone showed higher selectivities, and rates of binding. To determine the degree of binding as well of the not bound protein, as of the bound protein after denaturation and removal from the solid phase, were measured by UV spectroscopy. With several monomers of the glycopeptide library, a glycopeptide microarray with 96 pentameres was created. With this concept of synthesis, the binding of a complex carbohydrate recognizing domain to the mimetics was proven and thus the method was verified. The protein used was texas red labeled cholera toxin. In conclusion, the developed method is valid for the synthesis of oligosaccharide mimetics and for the screening with corresponding proteins. Furthermore, initial statements about the suitability of individual building blocks for the screening with cholera toxin can be made.