Das Proteintoxin Colicin M aus Escherichia coli: aktives Zentrum und spezifische Resistenz

Abstract

In Stresssituationen produzieren bis zu 50 % aller Escherichia coli-Stämme plasmidcodierte Proteintoxine, sogenannte Colicine, die andere E. coli-Zellen und nahe verwandte Stämme abtöten. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem kleinsten dieser Toxine, Colicin M. Als einziges Colicin inhibiert es die Mureinsynthese durch Hydrolyse des Phosphatesters zwischen dem Lipidcarrier Undecaprenol und der Mureinvorstufe N-Acetylmuramyl-(Pentapeptid)-N-Acetylglucosamin im Periplasma. Die kompakte Struktur des Proteins weist eine einzigartige Faltung auf. Bei Recherchen in Genom-Datenbanken konnte bislang kein Protein gefunden werden, das eine vorhergesagte Phosphatase-Aktivität besitzt und zugleich Ähnlichkeit zu Colicin M zeigt. In der vorliegenden Arbeit konnte das aktive Zentrum dieser neuartigen Phosphatase durch Mutationsstudien definiert werden. Dabei ist Asp226, das an der Oberfläche des Proteins exponiert ist, vermutlich direkt an der katalytischen Aktivität beteiligt. Die umgebenden Reste Asp225, Tyr228, Asp229, His235 und Arg236 unterstützen die Hydrolyse des Phosphoesters. Die exponierte hydrophobe Helix alpha1 konnte als die Region identifiziert werden, die mit dem Colicin M-Rezeptor FhuA in der äußeren Membran interagiert. Mutationen in FhuA oder im Ton-Komplex aus TonB, ExbB und ExbD, der die für die Colicin M-Aufnahme nötige Energie der protonenmotorischen Kraft von der inneren auf die äußere Membran überträgt, führen zu Colicin M-Resistenz. Die Toxizität von Colicin M hängt zudem streng vom periplasmatischen Protein FkpA ab, das neben seiner Chaperon- auch eine Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasedomäne besitzt. Eine Mutation in dieser Isomerase-Domäne verleiht Resistenz gegenüber Colicin M. Es wird vermutet, dass das Toxin während seiner Aufnahme über die äußere Membran entfaltet und im Periplasma mit der Unterstützung von FkpA rückgefaltet wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Prolyl-Peptidbindung Phe175-Pro176 als die Bindung identifiziert werden, die vermutlich das Substrat von FkpA darstellt und während der Rückfaltung cis zu trans isomerisiert wird. Der Chaperondomäne von FkpA wird dabei eine unterstützende Aktivität zugeschrieben. Des Weiteren wurde das Protein CbrA entdeckt, dessen Expression über das CreBC-Zweikomponentensystem reguliert wird und die Sensitivität gegenüber Colicin M herabsetzt. Dies stellt einen neuen Resistenzmechanismus dar, der unter Nährstoff-limitierten Wachstumsbedingungen, wie sie in natürlichen Habitaten von E. coli herrschen, dem Schutz der Zellen vor dem Toxin dient. CbrA wurde als FAD-abhängiges Protein identifiziert, das Homologie zu Geranylgeranyl-Reduktasen zeigt. Die Ursache der Colicin M-Resistenz wird in einer Änderung der Membranintegrität und/oder des Substrates von Colicin M vermutet.

Colicins are plasmid-encoded protein toxins released by Escherichia coli and taken up by sensitive E. coli cells and closely related strains. They are produced under stress conditions by up to 50 % of natural isolates. The smallest of these toxins, colicin M, is unique concerning its mode of killing. Acting as a phosphatase in the periplasm it inhibits the incorporation of the murein precursors into the existing peptidoglycan by cleaving the phosphate bond between the lipidcarrier C55-polyisoprenol and the murein precursor MurNAc(pentapeptide)-GlcNAc. The protein forms a compact structure showing a unique fold among colicins and even among all known proteins. To date no colicin M homolog with a predicted phosphatase activity was found. To study the active site of this novel phosphatase, mutants in the predicted activity domain were isolated and characterized. It is proposed that the exposed Asp226 directly participates in phosphate ester hydrolysis that is supported by the surrounding residues Asp225, Tyr228, Asp229, His235 and Arg236. Moreover, it was found that the hydrophobic helix alpha1 that extends from the compact structure of colicin M binds the toxin to the FhuA receptor in the outer membrane and is thereby involved in its uptake. Mutations in the FhuA receptor or the TonB complex result in colicin M resistance. This complex consisting of TonB, ExbB and ExbD transduces the energy of the proton motive force necessary for the colicin M import from the inner to the outer membrane. Furthermore, the toxicity of colicin M strictly depends on the periplasmic chaperone/peptidyl prolyl cis/trans isomerase FkpA. Mutations in this isomerase domain result in full resistance against colicin M. It is proposed that the toxin unfolds during import across the outer membrane. In the periplasm it has to be refolded to be toxic. The peptide bond Phe175-Pro176 was identified as the substrate of FkpA that is cis to trans isomerised during refolding. The refolding procedure is presumably supported by the chaperone domain of FkpA. Moreover it was found that the expression of cbrA regulated via the CreBC two-component system reduces the sensitivity against colicin M. This novel mechanism of colicin M resistance protects the cells under growth-limiting nutrient conditions that E. coli usually faces in natural habitats. CbrA was identified as a FAD-dependent protein showing homology to geranylgeranyl reductases. The reason for CbrA-confered colicin M resistance is not known, it is proposed that the protein modifies the E. coli outer membrane and/or the colicin M substrate.