Investigation of Chromosome Segregation and Protein Targeting in Staphylococcus aureus

DSpace Repository


Dateien:

URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-61314
http://hdl.handle.net/10900/49653
Dokumentart: Dissertation
Date: 2012
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biologie
Advisor: Götz, Friedrich (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2012-03-14
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
Keywords: Staphylococcus aureus , Segregation <Genetik> , Proteinsekretion , Fluoreszenz , Zellwand , Invasion <Biologie> , Autophagie <Physiologie>
Other Keywords:
Chromosome segregation , Protein targeting , Autophagy
License: Publishing license including print on demand
Order a printed copy: Print-on-Demand
Show full item record

Inhaltszusammenfassung:

Die Doktorarbeit behandelt ein Thema der bakteriellen Zellbiologie bei Staphylococcus aureus, einer der wichtigsten humanpathogenen Arten. Einblicke in die grundlegenden zellulären Prozessen, wie z. B. Chromosomensegregation, könnten als Grundlage für die Entwicklung neuer Angriffsorte für Antibiotika dienen. Der erste Teil befasst sich mit der Chromosomen-Segregation in S. aureus. Im Gegensatz zu stäbchenförmigen Modell- Bakterien, war in S. aureus eine SMC-Mutante (structural maintenance of chromosomes) nicht letal, und hatte nur leichte Mängel in der Organisation und Segregation der Chromosomen. Eine Doppel-Mutante von SMC und SpoIIIE, letztere codiert für eine aktive DNA-Translokase, führte zu schwerwiegenden Defekten in Wachstum und Chromosomensegregation. Ferner waren die SMC-Proteine als dynamische Punkte (foci) in einer Zellzyklus-abhängigen Weise in S. aureus lokalisiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass es deutliche Unterschiede in der Chromosomen-Dynamik zwischen den sphärischen Staphylokokken den stäbchenförmigen Bakterien gibt und lassen auf noch unbekannte Mechanismen schließen. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Lokalisierung der Oberfläche Proteine, die in S. aureus eine Schlüsselrolle in der Pathogenität spielen. Es wurde ein fluoreszenzmikroskopisches Verfahren entwickelt, um direkt die Lokalisierung von sekretierten und Zellwand verankerten Oberflächenproteinen bei S. aureus verfolgen zu können. Je nach dem, ob das rot fluoreszierendes Protein mCherry allein, mit dem Signalpeptide, oder zusammen mit der Zellwand-Sortierungssequenz fusioniert wurde, war mCherry etweder im Cytosol, dem Überstand oder der Zellwand lokalisiert; in allen Fällen zeigte mCherry helle Fluoreszenz. In Staphylokokken können zwei Arten von Signalpeptiden (SP) unterschieden werden: mit einem (+YSIRK) Motiv (SPlip) und ohne einem (-YSIRK) Motiv (SPsasF). mCherry-Hybride mit (+YSIRK) Motiv waren immer höher exprimiert als als jene ohne (-YSIRK) Motiv (SPsasF). Ferner waren mCherry-Hybride mit SPlip bevorzugt in der Querwand, während diejenigen mit SPsasF bevorzugt in der peripheren Wand lokalisiert. Bei Behandlung mit subletalen Konzentrationen von Penicillin oder Moenomycin, waren beide SP-mCherry Fusionen in der Querwand konzentriert. Der Effekt ist höchstwahrscheinlich auf die Antibiotika-vermittelte Erhöhung der freien Ankerplätze (Lipid II), dem Substrat der Sortase A (SrtA), an der Querwand zurückzuführen. SrtA war für diesen Effekt notwendig. Im letzten Teil (in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Dr. Proikas-Cezanne), wurde die Invasion von S. aureus in nicht-phagozytierenden Zellen (human osteosarcoma U2OS cell line stably expressing GFP-WIPI-1) und die Auslösung von Autophagocytose-Reaktionen untersucht. Es stellte sich heraus, dass die eingedrungenen S. aureus USA300, HG001, SA113 Zellen Autophagie auslösten und in und in intrazellulären Autophagosom-ähnlichen Vesikeln eingeschlossen waren. Agr-positive S. aureus Stämme wurden effizienter als agr-negativen Zellen eingeschlossen. Die eingeschlossenen S. aureus Zellen teilten sich noch. Wahrscheinlich werden die eindringenden S. aureus Zellen in Autophagosom-ähnliche Vesikel eingefangen und dem lysosomalen Abbau in die nichtprofessionellen Wirtszellen zugeführt.

Abstract:

The thesis addressed bacterial cell biological topics of Staphylococcus aureus, one of the most important human pathogens. Insights into essential cellular processes, such as chromosome segregation, could serve as a basis for developing new antibiotic targets. The first part deals with chromosome segregation in S. aureus. In contrast to rod-shaped model bacteria, an S. aureus smc (structural maintenance of chromosomes) mutant was not lethal, and had only mild deficiency in chromosome organization and segregation. Double mutations of smc and spoIIIE encoding an active DNA translocase resulted in severe growth defect and chromosome segregation impairment. Further, the SMC proteins localized as dynamic foci in a cell cycle dependent manner in S. aureus. These results unravel the differences in chromosome dynamics in the spherical staphylococcal cells compared to the model in rods and implies some yet unknown mechanisms. The second part deals with the localization of surface proteins that play key roles in S. aureus pathogenicity. A fluorescence microscopic method was developed to directly monitor the localization of secreted and cell wall anchored surface proteins in S. aureus. Dependent on the presence of signal peptides alone or together with the cell wall sorting sequence the red fluorescent protein mCherry could be targeted into the cytosol, the supernatant and the cell envelope respectively; in all cases mCherry exhibited bright fluorescence. In staphylococci two types of signal peptides (SP) can be distinguished: the +YSIRK motif SPlip and the -YSIRK motif SPsasF. MCherry-hybrids supplied with the SPlip were always expressed higher than those with SPsasF. Further, mCherry-hybrids with SPlip preferentially localized at the cross wall, while those with SPsasF preferentially localized at the peripheral wall. Interestingly, when treated with sub-lethal concentrations of penicillin or moenomycin, both mCherry-fusions with different SPs were concentrated at the cross wall. The effect is most likely due to antibiotic mediated increase of free anchoring sites (Lipid II) at the cross wall, the substrate of Sortase A (SrtA); SrtA was required for this shift. In the last part (in cooperation with the research group of Dr. Proikas-Cezanne), the invasion of S. aureus into non-phagocytic cells (human osteosarcoma U2OS cell line stably expressing GFP-WIPI-1) triggering host autophagic response was investigated. It was found that the invading S. aureus USA300, HG001, SA113 could stimulate autophagy, and became entrapped in intracellular autophagosome-like vesicles. Agr-positive S. aureus strains were more efficiently entrapped than agr-negative cells. The entrapped S. aureus still undergo cell division. Likely, the invading S. aureus become entrapped in autophagosome-like vesicles and are dedicated for lysosomal degradation in non-professional host cells.

This item appears in the following Collection(s)