Analysis of the Sll0783 Function in PHB Synthesis in Synechocystis PCC 6803: a Crucial Role of NADPH in N-Starvation

Abstract

Nitrogen frequently is a limiting nutrient in natural habitats. Therefore, cyanobacteria as well as other autotrophic organisms have developed multiple strategies to adapt to nitrogen deficiency. Transcriptomic analyses of the strain Synechocystis PCC 6803 under nitrogen-deficient conditions revealed a highly induced gene (sll0783 ), which is annotated as conserved protein with unknown function. This gene is part of a cluster with seven genes and in the upstream region lies a predicted NtcA-binding site. Homologues of this cluster occur in some unicellular, non-diazotrophic cyanobacteria, in several alpha-, beta- and gamma-proteobacteria as well as in some gram-positives. The common link between the heterotrophic bacteria seems to be the ability of nitrogen fixation and production of polyhydroxybutyrate (PHB), whereas among the cyanobacteria only Synechocystis PCC 6803 can accumulate PHB. In this work, a knockout mutant of this gene in Synechocystis PCC 6803 was characterised. This mutant was unable to accumulate PHB, a carbon and energy storage compound. The levels of precursor metabolites such as glycogen and acetyl-CoA were not reduced. The impairment in PHB accumulation correlated with a loss of PHB synthase activity during prolonged nitrogen starvation. We could show that the PHB synthase activity appeared to be a target of activity regulation, which was influenced by the NADPH/NADP+ ratio. The loss of PHB synthase activity in the Sll0783 mutant was caused by decreased NADPH/NADP+ ratio, which plays a crucial role in PHB synthesis.

Stickstoff ist häufig ein limitierender Nährstoff in natürlichen Lebensräumen. Aus diesem Grund haben Cyanobakterien und andere autotrophe Organismen verschiedene Strategien entwickelt, um sich an diese Mangelbedingung anzupassen. Transkriptomanalysen des Cyanobakteriums Synechocystis PCC 6803 zeigten, dass das Gen sll0783 unter Stickstoffmangelbedingungen besonders stark induziert wird. sll0783 codiert für ein konserviertes Protein mit unbekannter Funktion und ist Teil eines Clusters mit sieben Genen. Im Promotorbereich befindet sich ein NtcA-Bindemotiv. Homologe dieses Clusters sind in einigen einzelligen, nicht-diazotrophen Cyanobakterien, in mehreren alpha-, beta- und gamma-Proteobakterien, sowie in einigen grampositiven Bakterien nachgewiesen worden. Das gemeinsame Bindeglied zwischen den heterotrophen Bakterien ist die Fähigkeit Stickstoff zu fixieren und Polyhydroxybutyrat (PHB), ein Kohlenstoff- und Energiespeicher, einzulagern. Unter den Cyanobakterien ist nur Synechocystis PCC 6803 in der Lage PHB zu bilden. In dieser Arbeit wurde eine Knockout-Mutante des Gens sll0783 in Synechocystis PCC 6803 charakterisiert. Diese Mutante konnte nach Stickstoffentzug kein PHB mehr bilden. Während die Glykogen- und Acetyl-CoA-Konzentrationen in der Mutante nicht verringert waren, korrelierte die verminderte PHB-Bildung mit dem Verlust der PHB-Synthase-Aktivität. Es konnte gezeigt werden, dass die PHB-Synthase einer Aktivitätsregulierung unterliegt, welche durch das NADPH/NADP+-Verhältnis beeinflusst wird. Der Verlust der PHB-Synthase-Aktivität in der Sll0783-Mutante wurde durch ein reduziertes NADPH/NADP+-Verhältnis verursacht. Dies spielt eine Entscheidende Rolle in der PHB-Synthese.