Generation and Functional Characterization of a Transgenic Mouse Line Expressing a Ca2+ Biosensor in Cone Photoreceptors

Abstract

Kalzium (Ca2+) ist ein ubiquitärer und universeller „Botenstoff“, der auf der einen Seite eine Vielzahl von zellulären Prozessen unter physiologischen Bedingungen reguliert. Andererseits kann das Überschreiten der normalen räumlichen und zeitlichen Grenzen der Ca2+ Dynamik zum Zelltod führen. Zapfen-Photorezeptoren sind für das photopische Sehen verantwortlich und wandeln Lichtsignale in elektrische Signale um. Kalzium spielt mehrere wichtige Rollen in Zapfen-Photorezeptoren der Retina: Es moduliert die Phototransduktion im Außensegment sowie Stoffwechselvorgänge im Innensegment, und vermittelt die Transmitterfreisetzung an der synaptischen Endigung (Terminalien). Darüber hinaus implizieren Studien über Netzhautdegeneration, dass eine stark abweichende Ca2+-Homöostase am Zelltod von Zapfen-Photorezeptoren, z.B. bei Apoptose in hereditären Netzhautdystrophien, beteiligt ist. Daher ist die Untersuchung der subzellulären Ca2+-Dynamik in Zapfen-Photorezeptoren nicht nur entscheidend, um die Funktion von Zapfen-Photorezeptoren zu verstehen, sondern auch um wichtige Einblicke in die pathophysiologischen Vorgänge zu gewinnen, die in Zapfen-Photorezeptoren vor bzw. während ihrer Degeneration ablaufen. Zu diesem Zweck wurde eine transgene Mauslinie (HR2.1:TN-XL) generiert, in der Zapfen-Photorezeptoren selektiv den genetisch-kodierten ratiometrischen Ca2-Biosensor TN-XL exprimieren. Mittels immunohistochemischer Färbungen und ERG-Ableitungen konnten wir zeigen, dass TN-XL in beiden Typen von Zapfen-Photorezeptoren der Maus exprimiert wird und dass die Gegenwart des Biosensors die Funktion dieser Zellen nicht beeinträchtigt. Mittels Zweiphotonenmikroskopie wurden licht-induzierte Ca2-Antworten von einzelnen Zapfen-Photorezeptor-Terminalen gemessen und charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich mit dieser Methode die Ca2-Dynamik von Zapfen-Photorezeptoren besonders effizient untersuchen lässt, beispielsweise indem gleichzeitig verschiedene Komponenten bzw. Reaktionschritte der Phototransduktionskaskade pharmakologisch moduliert werden. Mit diesem Ansatz testeten wir die Hypothese, dass Stickstoffmonoxid (NO) die Ca2-Dynamik in den Terminalien von Zapfen-Photorezeptoren über einen Signalweg moduliert, der eine lösliche Guanylatzyklase (sGC) involviert (NO-sGC Signalweg). Wir konnten bestätigen, dass das Ca2-Niveau in Zapfen-Photorezeptoren unter Ruhebedingungen durch NO moduliert werden kann. Allerdings fanden wir keinen Beleg für eine Beteiligung des vorgeschlagenen NO-sGC Signalwegs. Zusammenfassend kann man sagen, dass die hier erzeugte HR2.1:TN-XL Mauslinie ein wichtiges „Werkzeug“ darstellt, um die Licht-induzierte Ca2-Dynamik und deren Regulation in den Zapfen-Photorezeptoren der Maus unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen aufzuklären.

Calcium (Ca2+) is a universal and ubiquitous signaling messenger that controls a large variety of cellular processes under physiological conditions. Deviations from the normal range of spatial and temporal Ca2+ dynamics can result in cell death. Cone photoreceptors are responsible for photopic vision and convert light signals into electric signals. Calcium plays multiple roles in cone photoreceptors of the vertebrate retina including modulating phototransduction in the outer segment, metabolic processes in the inner segment and mediating transmitter release at the synaptic terminal. Furthermore, studies on retinal degeneration strongly imply the involvement of an aberrant Ca2+ homeostasis in cone photoreceptor cell death, e.g. apoptosis in hereditary retinal dystrophies. Therefore, to monitor the subcellular Ca2+ dynamics in cones is crucial not only for understanding cone function but also to gain important insights into the pathophysiological processes that occur in cones before and during degeneration. To this end, a transgenic mouse line (HR2.1:TN-XL) was generated in which cone photoreceptors selectively express the genetically encoded ratiometric Ca2+ biosensor TN-XL. With immunohistochemistry and ERG recordings we confirmed that TN-XL is expressed in both types of mouse cones and that the biosensor’s presence does not affect photoreceptor function. Light-evoked Ca2+ responses from single cone terminals were characterized via two-photon imaging – demonstrating that cone Ca2+ dynamics can be easily studied through the pharmacological modulation of different components/steps of the phototransduction cascade. Using this approach, we tested the hypothesis that nitric oxide (NO) modulates the Ca2+ dynamics in cone terminals via the “classical” soluble guanylate cyclase (sGC) dependent pathway (NO-sGC pathway). While it was confirmed that Ca2+ resting levels in mouse cones can be modulated by NO, no evidence was found that supports an involvement of the NO-sGC pathway. In conclusion, the HR2.1:TN-XL mouse line offers a great opportunity to elucidate the light-driven Ca2+ dynamics and its regulation in mouse cone photoreceptors under physiological and pathophysiological conditions.